敲除小鼠见问题与回答.docxVIP

敲除小鼠常见问题与回答?一、什么是ES细胞显微注射？?答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。?二、嵌合体?遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。?三、条件性敲除的原理？?答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。?四、如何鉴定和挑选嵌合体？?答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。?五、ROSA26与定点插入？?答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。10、何谓Flox小鼠？??所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。这段序列就是Flanked?by?LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。?11、条件性敲除设计中，为什么在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统？?在设计中，其中的一个系统是为了把抗性基因去掉。另一个系统是为了把目的基因去掉。Frt-Flip系统或Cre-Loxp系统都可以用来放在抗性基因或是目的基因外显子的两侧。理论上是没有区别的。只所以“在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统”，主要有以下几个原因：?1）工具鼠：Cre-LoxP系统已经用了将近20年了，科学家研发了很多的Cre工具鼠。其实目前绝大部分工具鼠都是Cre工具鼠。现在大家做一个Flox(Flanked?By?LoxP)小鼠花费很多的时间和金钱，都会希望自己的小鼠与更多的工具鼠交配，得到更多的结果。?2)?Flip酶的活性比较低。Flip酶是从酵母中分离出来的。其最适温度是30度，而小鼠的体温是37度。尽管现在有些实验室对Flip的37度适应性做了优化，但应该还是没有Cre的活性好。把Frt放在抗性基因的两侧，得到小鼠之后，跟Flip?Deleter小鼠交配，筛选出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。即使Flip的活性不高，也可以得到Flox小鼠。这些Flox小鼠可以跟各种Cre工具鼠交配，得到条件性敲除小鼠。反过来，如果用Cre来去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。这种情况下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。?如果看5、6年前的文章，大家其实是把Loxp不仅放在要敲除基因的两侧，也用来敲除抗性基因(NeoR)。那个时候筛选起来特别麻烦。因为要做大量的筛选，筛出只敲掉抗性基因，而没有敲掉目的基因的Flox小鼠。需要很多的时间和精力。?12、怎样用最简单的描述区分基因敲除、基因敲进、基因敲降、和转基因?1）基因敲除（Knockout)：把一个基因从基因组里面全部或部分拿掉；?2）条件性基因敲除（Conditional?KO):?把一个基因从特定细胞的基因组里面全部或部分拿掉；?3）基因敲进（Knockin)：在基因组里放一个外源基因（如GFP,?LacZ,?T