激光扫描聚焦显微镜.pptVIP

主要内容 1、分子荧光的形成 2、微生物研究中常用的荧光染料 3、共聚焦显微镜基本原理 4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用 一、分子荧光的产生 1.1 分子荧光产生的条件 1. 基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至激发态, 通常为π→π*、n→π*跃迁 2. 激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光） 1.2 影响荧光的因素 1. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化 2. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加 3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制 二、微生物研究中常用的荧光探针 荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类 1、膜通透性（membrane integrity） 2、代谢活性(metabolic activity) 3、膜电位(membrane potential) 4、酯酶活性(esterase activity) 5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它 1、膜通透性(membrane integrity) BacLight Live/Dead (PI/SYTO9) 2、代谢活性(metabolic activity) 微生物代谢活性分析的荧光探针主要有： 5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2-tetrazolium bromide (MTT) 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide (INT) Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC 3、酯酶活性(esterase activity) 工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保留于胞内 1. Fluorescein diacetate (FDA) 2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE) 4、膜电位（membrane potential） 工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位，可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标 1. 带正电荷荧光探针 Rhodamine 123 (Rh123); DiOC6(3) 进入活性细胞 2. 带负电荷荧光探针 Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol DiBAC4(3) 进入死细胞 5、pH荧光探针 工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH梯度，因此，测定微生物细胞内的pH可作为细胞生理状态的一个评价标准 1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE) 2. Pranine 3. BCECF More Color Possibilities Example 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy 样品的3D-重建 激光扫描共聚焦显微镜主要功能 1、荧光定性 2、荧光定量 3、动态荧光监测 4、断层扫描 5、三维重构 6、共聚焦图像分析 7、荧光显微切割 四、激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用 4.1 共聚焦在链霉菌研究中的应用 1、发育分化的研究 2、内部结构及活性研究 3、菌体大小测量 4、产物合成的研究 4.2 共聚焦在真菌研究中的应用 1、真菌浸染机制的研究 2、真菌发育分化的研究 3、真菌生长的研究 4、真菌活性的研究（FDA/PI） 5、真菌的原位研究 6、真菌细胞融合的研究 7、一些机制的研究，如胞吞等 4.3 微生物的群落分析 1、环境中微生物的分布及活性的原位分析（光学切片功能） 2、食品污染分析 1、荧光原位杂交研究（In situ hybridization） 2、生物膜的研究(bioflim) 3、细菌在植物根部的定植研究 4、细菌的活性分析 5、抗菌分析 实验：激光扫描共聚焦显微基本步骤 1、选择荧光探针：主要依据实验目的，选择好荧光探针，目前，荧光探针的种类已经成千上万，人们可以根据所研究问题的不同，选