第九课 氯化钙法制备感受态细菌 质粒DNA与外源DNA的连接反应.pptVIP

第一部分 氯化钙法制备感受态细菌 实验原理 该方法是Cohen等人于1972年发明的。 用冷的低渗CaCl2 （0.1M）溶液处理对数期的细菌，可使细菌膨胀，细胞膜的通透性发生变化，处于易于接受外来DNA的状态。细菌的这种状态即称为感受态； 转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物黏附于细胞表面； 经42℃短暂热激后，促进细胞吸收DNA复合物； 经丰富培养基培养后，球状细胞复原并分裂繁殖。 用此方法制备的感受态细菌可以得到每微克超螺旋质粒DNA5X106到2X107的克隆。这种转化效率已经完全可以满足常规的质粒克隆的要求 实验试剂 1，0.1M CaCl2（过滤除菌）、 2，无菌甘油（高温消毒） 3，含50%甘油的0.1M CaCl2（用经高温消毒的甘油和经过滤除菌0.1M CaCl2配置） 实验步骤 将保存于-80℃冰箱的大肠杆菌划线于LB平板上，在37℃恒温培养过夜(16-18h)。 挑取单菌落于5mL LB培养基中37℃、200 rpm培养过夜。 按1/100的比例将过夜菌接种于适量 LB培养基中，37℃、250 rpm培养至OD600值约为0.3。 冰上冷却15min。 取1.5ml冷却的菌液加入在冰上预冷的无菌离心管中。 4℃ 4000rpm离心5min。 实验步骤 弃上清，吸去残留的培养液。 加入1 ml冰上预冷的0.1mol/L CaCl2溶液,轻弹离心管底部并颠倒离心管使细菌充分悬浮。 4℃ 4000rpm离心5min。 重复步骤7，8，9。 弃上清，吸去残留的CaCl2溶液。 加入60μl预冷的0.1mol/LCaCl2溶液 轻轻弹拨离心管管底，使细菌充分重新悬浮，冰上放置2小时。 加入30μl预冷的含50％甘油的无菌0.1mol/LCaCl2溶液，轻弹离心管底部混匀。 -80℃超低温冷冻贮藏备用。 注意事项 所用器具的洁净程度非常重要。 用于制备感受态的细菌应处于对数生长期，培养液OD600不得大于0.6。 尽量去除培养液有助于提高感受态效率。 加氯化钙后的操作要轻柔，不能用力振荡或者吹吸细菌。 液氮速冻或在0℃放一到两天可提高感受态的效率。 感受态细菌可保存于-80?C，保存时间过长将使转化效率下降。 第二部分 质粒DNA和外源DNA的 连接反应 实验原理 外源DNA片段和线状质粒DNA的连接，就是在双链DNA５’磷酸基团和相邻的3’羟基之间形成的新的共价链。如果质粒和外源DNA的两条链都带5’磷酸基团和3’羟基，则可生成４个新的磷酸二酯链，成为环状的双链重组质粒。 实验原理 DNA连接酶 DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶，Ｔ４噬菌体DNA连接酶。后者常用。 Ｔ４噬菌体DNA连接酶催化相邻DNA链的5′-P末端和3′-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间的连接。 T4 DNA连接酶活力单位的定义主要有粘端连接单位（cohesive-end ligation unit），d（A-T）环化单位和Weiss 单位（Weiss unit）。 实验原理 Takara公司T4DNA连接酶酶粘端连接单位：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。 实验原理 DNA连接酶 保存液为10mmol/L Tris.Cl (pH7.5)、50mmol/L KCl、1mmol/L二硫苏糖醇、0.1 mM EDTA、50％甘油，于-20℃保存。 10×T4 DNA Ligase Buffer：Tris-HCl(PH7.6) 660mM, MgCl2 66mM, DTT 100mM, ATP 1mM 实验原理 连接反应的分子动力学 双链DNA5磷酸基团和相邻的3羟基之间的连接反应可以看作是双分子反应，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。 DNA末端可以是分子内的，也可以是分子间的。分子内的DNA末端连接反应产生自身连接产物。 当连接体系中只有一种分子时，如分子两端的DNA末端互相匹配，DNA可自身环化，或形成二聚体和更大的寡聚体。影响因素有：DNA分子的长度、浓度、刚度（取决于缓冲液的离子强度）。 实验原理 连接反应的分子动力学 外源ＤＮＡ末端浓度高于载体DNA的末端浓度时，有效重组体的产量增加。 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3～10倍。 实验原理 减少质粒自身环化的措施 脱磷酸化：当载体为单酶切产物时，用碱性磷酸酶脱磷酸化可防止载体自身环化。 双酶切产生不同的粘性末端：好处是不但可以防止质粒自身环化，还可实现定向克隆。 适当增加外源DNA和质粒DN