第10篇 分子杂交技术hu.pptVIP

第十章 分子杂交技术 分子杂交（molecular hybridization）是用一个DNA单链或RNA单链与另一被测DNA单链形成双链，以测定某特异顺序是否存在。 Basic Principle 第十章 分子杂交技术 第一节 分子杂交 第二节 核酸杂交简史与原理 第三节 核酸探针标记的方法 第四节 核酸分子杂交因素 第五节 几种常见的杂交 第六节 其他类型杂交介绍 第七节 原位杂交 第一节 分子杂交 1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） 1.2 斑点杂交（dot blotting） 1.4 Northern hybridization 1.5 Western blotting 1.6 电镜观察 1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） 原位分子杂交有两种: 玻片原位杂交 膜上原位杂交 ①玻片原位杂交 一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等; 片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱； 若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复盖上一张同样大小X光片进行放射自显影，然后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位置。 如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。 ②膜上分子杂交 将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），这种膜只吸附单链DNA。 将影印好的膜用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上； 然后用无关的单链DNA，如常用小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上，干挠实验结果。 膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。 1.2 斑点杂交（dot blotting） 也叫狭缝杂交。是由Southern blot衍生而来。方法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上，或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。 再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分析DNA样品之间的同源性。 此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一步做Southern blotting加以验证。 1.3 Southern blotting 该技术是Southern，E.M于1975年首先建立的，故称为Southern杂交，该方法经Southern印迹法将胶上的电泳条带吸印尼龙膜上，然后和DNA探针杂交。 用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片段长度的多态性，及动物园吸印（Zoo blot）（用一个物种的DNA探针和别种动物的DNA进行Southern blotting）等。 1.4 Northern hybridization Northern杂交的技术和Southern杂交相似，作者并不姓“Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称自己的分析方法为“北方”“（Northern）杂交。 Northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验RNA，而不是DNA。 首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然后用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。 电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时空特异性。 1.5 Western blotting 既然有了“南方”杂交，“北方”杂交，那么随之而来的就是“西方”杂交（Western blotting），但Western blotting和前面的几种杂交都不相同，它是用来测蛋白而不是检测核酸。 此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质技术。 1.6 电镜观察 先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内含子的探测以及缺失的确定等。 断裂基因就是用这种方法发现的。 电镜观察有二种，一是异源双链定位法（Heferoduplex mapping），二是R-环定位法（R-loop mapping） 将异源DNA双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜下观察，可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。 R-环法是将标记的mRNA和变性后的待测双链DNA进行杂交，制片后，可以观察到R-环，这是由于RNA形成的双链比原来的DNA双链更为稳定，将一条DNA单链置换了出来，表明该mRNA基因就位于R-环这个位置。 第二节 核酸杂交简史与原理 2.1 核酸杂交