Th17细胞在小鼠H22原位肝癌模型中表达和意义.docVIP

Th17细胞在小鼠H22原位肝癌模型中表达和意义 　　[摘要] 目的 检测小鼠原位肝癌模型中Th17细胞的表达，探讨其在肝癌免疫中的作用。 方法 30只Balb/C小鼠随机分为肝癌模型组（10只）、生理盐水对照组（10只）、空白对照组（10只），流式细胞术检测小鼠分离纯化后的各组新鲜脾脏Th17细胞的相对比例；实时RT-PCR检测各组肝组织IL-17基因和RORγT基因表达水平。 结果 肝癌模型组脾脏Th17/ CD4+T细胞的比例高于生理盐水对照组脾脏、空白对照组脾脏，差异有统计学意义（P 0.05）。肝癌模型组肿瘤组织IL-17 mRNA和RORγT mRNA的表达水平均高于各自对照组，差异有统计学意义（P 0.05）。 结论 Th17细胞在小鼠原位肝癌模型中数量增多，IL-17表达升高，增强免疫反应，但在肝癌免疫中的作用及机制复杂，有待深入研究。 　　[关键词] 肝癌模型；Th17细胞；IL-17；RORγT 　　[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）35-0005-03 　　肝细胞癌（hepatocellutar carcinoma，HCC）是世界上最多见的五大恶性肿瘤之一，死亡率列前三位[1]，我国是HCC多发国家。但目前以手术为主的综合治疗方法疗效仍不理想，故近年来免疫治疗越来越受到重视。 　　Th17细胞是一种以分泌IL-17为主要特征的CD4+T细胞，孤核受体RORγT是其特异的转录因子。Th17细胞首先是在EAE和CIA的研究中被发现，现研究表明IL-17的表达和人类很多自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病等[2-4]。最近研究发现，在一些肿瘤患者或小鼠肿瘤模型的肿瘤标本中Th17细胞明显升高，但是关于Thl7和HCC的研究，国内鲜有见到相关的报道。故本研究通过建立Balb/C小鼠原位荷瘤模型，检测脾脏中Th17细胞的比例、肿瘤微环境中IL-17基因和RORγT基因的表达，为能进一步系统地研究Th17细胞在肝癌免疫中的作用和机制打下良好的基础。 　　1 材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1动物：6～8周龄SPF级雄性Balb/C小鼠，体重（20±2）g。30只小鼠随机分为肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组，各10只进行实验。 　　1.1.2肿瘤细胞株 鼠源性H22腹水型肝癌细胞株。 　　1.1.3抗体和试剂 FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse IL-17A购自美国BD公司；SYBR Green Supermix 购自美国Bio-rad，PCR引物由上海浦生生物科技有限公司合成。 　　1.2方法 　　1.2.1 小鼠原位肝癌模型的建立 H22肝癌细胞注入Balb/C小鼠腹腔，后抽取癌性腹水调整细胞浓度备用。肝癌模型组：小鼠麻醉后，开腹直视下将0.01 mL癌细胞悬液注入肝脏。生理盐水对照组：肝内注入0.01 mL生理盐水。模型制作后第30天处死小鼠取肝脏肿瘤组织固定，常规HE染色， 进行病理组织学诊断。 　　1.2.2 Th17细胞流式检测 ①取肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组脾脏，机械法分离细胞，红细胞裂解液去除红细胞。②获得的各组脾脏单个核细胞按照免疫磁珠操作规程分选CD4+T细胞。③CD4+T细胞接种于24孔培养板，加入PMA，Ionomycin，Monensin，使其终浓度分别为125 ng/mL，1 μg/mL 和1。6 μg/mL，在37℃、5%二氧化碳的环境下培养4h。④取细胞悬液，先后加入CD3-PE-CY5，FITC Rat anti-mouse CD4标记细胞表面抗原，PE Rat Anti-Mouse IL-17A胞内染色，设同型对照组。用FACS Calibur流式细胞仪检测，以CD4，IL-17A双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比记录结果。 　　1.2.3 实时荧光定量PCR检测 Trizol法提取各组总RNA，反转录合成cDNA。由SYBR Green Supermix，forward primer，reverse primer，cDNA等试剂建立一个10 μL 的反应体系（引物设计见表1），放入ABI高通量荧光定量PCR仪7900HT进行反应，反应条件：开始50℃ 2 min ，95°C 10 min，接着95°C 15 s 和 60°C 1 min共45个循环。最后根据待测基因和内参的循环数CT值，使用2 -△△CT方法进行相对定量结果分析。 　　1.3统计学方法 　　采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较均采用单因素方差分析，P 0.05），见