Th1、Th2、Th17细胞变化及环境因素与习惯性流产关系研究.docVIP

Th1、Th2、Th17细胞变化及环境因素与习惯性流产关系研究 　　河南省开封市妇产医院，河南开封 475000 　　[摘要] 目的 探讨Th1、Th2和Th17细胞的变化、转录因子T-bet、GATA-3和STAT-3 mRNA的表达及环境因素与习惯性流产的关系。 方法 选取2011年6月～2012年9月河南省开封市妇产医院就诊的50例习惯性流产非孕期患者作为病例组（HA组），同期某社区50例正常非孕妇女为健康对照组（NNP组），分别抽取抗凝静脉血5 mL，应用聚多糖密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），采用流式细胞仪检测三种亚群细胞的比例，酶联免疫吸附法（ELISA）检测IFN-γ、IL-4和IL-17的含量，实时荧光定量PCR检测T-bet、GATA-3和STAT-3 mRNA的表达。同时进行环境因素问卷调查，比较两组各环境因素的差异。 结果 ①HA组患者Th1、Th17细胞百分比[（11.66±3.45）%、（3.65±0.75）%]均明显高于NNP组[（7.05±1.83）%、（0.72±0.11）%]，差异有统计学意义（P 　　[Key words] T lymphocytes subset； Environmental factor； Habitual abortion； Transcription factor 　　习惯性流产（habitual abortion，HA）是妇产科常见的一种疾病，发病主要与母体生殖道异常、母体内分泌异常、染色体异常、生殖道感染、宫颈功能不全及免疫功能异常等有关，约50%的HA病因不明[1]。随着人们对疾病的免疫学发病机制研究的不断深入，尤其是对辅助性T细胞的深入研究，国外学者发现，T细胞亚群分化失衡与HA密切相关，且受到相关转录因子的调控[2]。同时，环境因素也不容忽视，如吸烟[3]、饮酒[4]、家族史[5]、体重指数（BMI）[6]等。本研究以50例HA非孕期患者和50例正常非孕妇女为研究对象，采用问卷调查、酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时荧光定量聚合酶链反应（RTQ-PCR）等技术，统计分析问卷调查结果，测定患者外周血Th1，Th2，Th17的百分比，细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17的表达水平及相关转录因子T-bet、GATA-3和STAT-3 mRNA的含量。旨在探讨HA患者Th1、Th2、Th17细胞变化及环境因素与HA的关系。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选择2011年6月～2012年9月河南省开封市妇产医院就诊的50例非孕期HA患者（HA组），以及同期50例健康非孕期妇女（NNP组）。HA组纳入标准：①年龄20～40岁；②有两次或两次以上自然流产史??③无糖尿病、高血压、生殖器畸形等器质性疾病。NNP组纳入标准：①年龄21～40岁；②与HA组无血缘关系；③无自然流产史，无肾炎、肝病、生殖器感染等病史。所有研究对象均知情同意并签署知情同意。 　　1.2 主要试剂和仪器 　　莫能霉素、离子霉素和PMA购自Takara公司，RPMI-1640、小牛血清购自Sigma公司，TapDNA聚合酶购自北京天根公司，ELISA检测试剂盒购自上海生工，流式细胞仪购自美国Guava。 　　1.3 方法 　　1.3.1 分离和体外培养PBMC 采集患者抗凝静脉血5 mL，收集其中的单个核细胞层，加入PBS 3 mL，1200 r/min离心洗涤10 min，弃上清。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬。在24孔板上加入PBMC，同时加入莫能霉素（2 μg/mL）、离子霉素（1 μg/mL）和PMA（25 μg/mL），5 h后收集细胞，对细胞表面的CD分子和胞内的IFN-γ、IL-4、IL-17及相应的对照抗体染色，利用流式细胞仪进行检测。 　　1.3.2 血清中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量测定 按照ELISA试剂盒要求对患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量进行检测。 　　1.3.3 RTQ-PCR检测T-bet、GATA-3和STAT-3 mRNA的表达 将提取的总RNA逆转录成cDNA，运用RTQ-PCR技术扩增T-bet、GATA-3和STAT-3 mRNA。PCR反应体系：10×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 5 μL，cDNA 2 μL，Primers 各20 μmol/L，Tap酶0.25 μL，总反应体系50 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 45 s；55℃ 50 s；72℃ 1 min；30个循环；72℃延伸10 min。扩增所需引物见表1。 　　表1 扩增T-bet、GATA-3和STAT-3所需引物 　　1.3.4 问卷调