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一颅锁骨发育不全综合征家族RUNX2基因分析研究 　　[摘要] 目的 检测一个颅锁骨发育不全综合征（CCD）家系RUNX2基因突变情况。方法 采用先证者查证法，对CCD家系各成员进行全身健康状况及口腔专科检查，拍摄X线片；抽取先证者及其父母、姐姐外周静脉血，提取基因组DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增RUNX2基因并测序，将先证者及其父母、姐姐RUNX2基因测序结果进行Blastn比较分析。结果 在先证者RUNX2基因的外显子2上发现了一个C→T突变，此突变来自母系染色体该基因568位点的基因突变；密码子CGG→TGG引起RUNX2编码的转录因子第190位保守的精氨酸变成色氨酸，突变型为c.568CT。结论 c.568CT突变是导致该家系发病的分子基础。 　　[关键词] 颅锁骨发育不全综合征； RUNX2； 基因突变 　　[中图分类号] R 781.6 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.019 　　颅锁骨发育不全综合征（cleidocranial dyspla-sia，CCD）是一种累及骨骼和牙齿的常染色体显性遗传性疾病[1]，具有明显的家族聚集性，男女发病率无明显差别，临床发病率约为1：1 000 000。CCD常见的临床症状有囟门闭合延迟或不闭合，颅骨缝增宽，锁骨钙化不良、缺失或部分缺失，锥形胸，耻骨联合增宽而致骨盆发育不良，身材矮小等；口腔表现常见上颌骨发育不足，有多生牙，乳牙滞留，恒牙萌出延迟或埋伏牙等症状[2-5]。目前CCD的发病机制尚不清楚，本研究采用分子生物学的方法对1个颅锁骨发育不全家系的患者进行RUNX2基因测序分析研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 研究对象 　　CCD家系1个，来自山东省济南市，家系图见图1。先证者，女，29岁，2010年6月因“牙齿不齐，咀嚼困难”到济南市口腔医院修复科就诊，要求修复上下牙列缺损。采用先证者查证法，对家系各成员进行全身健康状况及口腔专科检查。查体：先证者反，混合牙列，恒牙仅16、17、26、27、36、37、46萌出，全部乳牙均滞留，11～15、21～25、31～ 　　35、41～45未萌，65、71、72、73、75、81、82、83、85松动Ⅱ度；颅骨和面部比例失调，头大面小，前额及顶部突出呈方形，前囟门未闭合，从额部到枕部中线区有明显凹陷；面中部发育不足，凹面型，眶距增宽；上颌骨及颧骨发育不足，下颌骨发育相对正常；肩部窄小，胸部呈圆锥形，锁骨短小，仅在近胸骨处可扪及，双肩下垂并可在胸前并拢。X线（图2）检查：上下颌骨内有埋伏牙，滞留乳牙牙根未见明显吸收，前囟门未闭合，颅缝增宽，并见多块缝间骨，双侧肩胛骨较小，呈翼状，位置下垂，双侧锁骨肩峰端部分缺如，耻骨联合间隙增宽，骶髂关节轻度增宽。先证者及其母亲的临床表现和X线特征均符合CCD特征。该家系中3代共15位成员，其中CCD患者2例：先证者及其母亲，其母亲自述先证者姥姥、姥爷和其兄弟姐妹无类似症状。 　　箭头所指为先证者，Ⅰ～Ⅳ代表代数。 　　图 1 患者家族谱系图 　　Fig 1 The pedigree of the involved family 　　1.2 基因组DNA提取及测序ⅡⅢ 　　1.2.1 DNA提取 抽取先证者及其父母、姐姐外周静脉血各2 mL，放入干冰冻存，使用Universal Ge-nomic DNA Extraction Kit试剂盒进行DNA 提取，取 1 μL进行琼脂糖凝胶电泳，获得基因组DNA。 　　1.2.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 参照文献[6]的方法设计7对寡核苷酸引物（表1），然后对RUNX2 基因分别使用TaKaRa LA Taq?、TaKaRa MightyAmp DNA Polymerase?进行套式PCR 扩增，反应体系及方法按照说明书进行。 　　1.2.3 基因测序及突变位点分析 使用TaKaRa Aga-rose Gel DNA Purification Kit切胶回收目的片段进行测序，测序由宝生物工程（大连）有限公司完成，并对测序结果进行Blastn比较分析。 　　2 结果 　　将先证者的RUNX2基因测序结果进行Blastn比较分析，在Exon 2上发现了一个C→T突变，实际测序图谱显示双峰结构（C、T）；对于其CCD母亲的基因检测结果表明，此突变来自母系染色体该基因568位点的基因突变；密码子CGG→TGG可能引起RUNX2编码的转录因子第190位（R190W）保守的精氨酸变成色氨酸。该突变型为c.568CT，CGG 　　TGG。先证者的父亲、姐姐的测序结果显示，在同一位点显示C的单峰，即与Blastn中健康人的序列相同（