六种天然多酚类化合物对沙门菌生物被膜形成抑制作用研究.docVIP

六种天然多酚类化合物对沙门菌生物被膜形成抑制作用研究 　　[摘要] 目的 研究植物来源的天然多酚类化合物对沙门菌生物被膜形成的影响，筛选具有抑制作用的化合物，为沙门菌的防治提供技术支持。 方法 利用结晶紫染色法，研究不同化合物在26℃或37℃条件下对沙门菌生物被膜形成的影响。 结果 与空白对照二甲基亚砜（DMSO）相比较，化合物水杨酸在各种条件下均未对沙门菌生物被膜形成表现出明显的抑制作用；在26℃及37℃条件下培养36 h，阿魏酸、蔓荆子黄素、绿原酸和肉桂酸均表现出显著抑制沙门菌生物被膜形成的作用；而咖啡酸在26℃条件下对沙门菌生物被膜形成具有显著抑制作用，37℃条件下却没有表现出明显的抑制作用。 结论 该实验结果说明天然多酚类化合物阿魏酸、蔓荆子黄素、绿原酸和肉桂酸在一定条件下均可以显著抑制沙门菌生物被膜的形成，具有较强的生物活性。 　　[关键词] 多酚类化合物；沙门菌；生物被膜；结晶紫 　　[中图分类号] R378.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（a）-0026-03 　　肠道沙门菌是一种人、畜共患的革兰阴性致病菌[1]。人类感染通常与直接或间接接触肉食性动物有关，依赖于血清变型和宿主专门的因子，肠道沙门菌能引起一系列炎症、腹泻、伤寒型发烧等疾病反应[2-4]。人类最常见的肠道沙门菌血清变型主要有两种：鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，发病率超过肠道沙门菌发病率的75%[5]。由于鼠伤寒沙门菌广泛的宿主范围（能引起人和牛的肠胃炎，以及老鼠的系统性感染），重要的致病性和死亡率，现已经成为人类的一个沉重的经济负担[5-6]。而且，鼠伤寒沙门菌耐药菌株不断出现，对于公众带来更大的健康威胁[7]。因此，沙门菌新型抗菌剂的研究具有非常重要的意义和作用。 　　生物被膜，是微生物黏附在固体物体如塑料、金属等植入体或人体表面等形成的生物膜，能够引起持续的污染，并具有非常强的致病性和抗药物能力[8]。沙门菌作为食源性致病菌，易在食物表面和宿主肠道表面形成生物被膜，以促进沙门菌在人体的繁殖。因此筛选抑制沙门菌生物被膜形成的化合物，对于有效防治该致病菌具有非常重要的意义。本实验通过考察六??天然多酚类化合物对沙门菌生物被膜形成的影响，旨在发现对沙门菌生物被膜有较强抑制作用的化合物。 　　1 仪器与试药 　　1.1 实验仪器 　　酶标仪Bio-Rad 680（美国伯乐公司产品），摇床（New Brunswick公司产品），隔水培养箱（精宏仪器厂），超净工作台（Airtech公司产品），离心机（德国Eppendorf公司产品），灭菌锅（三洋公司产品）。 　　1.2 试剂 　　水杨酸，咖啡酸，蔓荆子黄素，绿原酸，肉桂酸和阿魏酸均购自中国药品生物制品检验检定所。二甲基亚砜（DMSO），结晶紫，L-阿拉伯糖，胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉和NaCl均为上海生工生物工程公司产品。 　　1.3 菌株及培养基 　　鼠伤寒沙门菌购于中国典型培养物保藏中心，于LB培养基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH 7.4）中培养。 　　2 方法与结果 　　2.1 试剂的配制 　　2.1.1 LB培养基的配制[9] 精密称取10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物和10 g NaCl溶于900 mL蒸馏水中，搅拌完全溶解后，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4，然后定容至1 L，120℃高压灭菌20 min后，4℃保存备用。 　　2.1.2 LB固体培养基的配制 每升LB液体培养基中加入15 g琼脂粉搅拌均匀后，120℃高压灭菌20 min，待培养基冷却至50℃左右时，混匀，然后将培养基倒入已灭菌的玻璃平板中，每块平板约20 mL培养基，室温冷却凝固后，4℃保存备用 　　2.1.3 1%结晶紫溶液（W/V）的配制 精密称取结晶紫粉末1 g，溶解于90 mL超纯水后，搅拌溶解，然后定容至100 mL，室温保存备用。 　　2.1.4 筛选化合物母液的配制 精密称取6个天然多酚类化合物2～3 mg，根据其分子量，加入相应体积的DMSO溶液，制成100 mmol/L的储备液，涡旋混匀完全溶解后，-20℃保存备用。 　　2.2 鼠伤寒沙门菌的培养 　　用灭菌好的取菌环取-80℃保存的鼠伤寒沙门菌菌液适量，采用连续稀释划线的方法接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。第2天，挑取单菌落，接种于2 mL LB液体培养基中，26℃振荡培养过夜，制备菌株种子液备用。 　　2.3 化合物对生物被膜形成的影响 　　本实验采用结晶紫染色法[10]考察不同化合物在不同培养温度下对沙门菌生物被膜形成的影响。方法如下： 　　2.3.1 第一步 取2 mL沙门菌种子液，按1∶100稀释后，得20 mL稀释菌液。分