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塞来昔布提高耐长春新碱细胞株KBVCR细胞化疗敏感性研究 　　[摘要] 目的 研究选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布影响口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞对长春新碱敏感性的效应，探讨其作用机制。方法 采用MTT法分别检测塞来昔布组、长春新碱组、塞来昔布+长春新碱组、塞来昔布+长春新碱+前列腺素E2（PGE2）组对KB/VCR细胞的生长抑制作用，用Western印迹法检测P-糖蛋白（P-gp）、Bcl-2和Bcl-XL的表达，流式细胞术检测塞来昔布对KB/VCR细胞凋亡的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果 塞来昔布+长春新碱组的细胞生长抑制率高于塞来昔布组、长春新碱组及塞来昔布+长春新碱+PGE2组（P 　　组，塞来昔布+长春新碱+PGE2组细胞凋亡率显著低于塞来昔布+长春新碱组（P 　　[Key words] KB/VCR cell； multidrug resistant； P-glycoprotein； cycloxygenase-2 inhibitor； apoptosis 　　口腔癌是常见的口腔头颈部恶性肿瘤之一，近年来口腔癌的发病率呈现明显增高趋势，已成为威胁人类健康的重要因素之一。化疗是口腔癌重要的辅助治疗方法之一，目前化疗所面临的主要问题是癌细胞对化疗药物的敏感性下降，导致多药耐药（multidrug resistant，MDR）的产生，使癌细胞产生 　　抵抗广谱化疗药物的能力。 　　近来研究[1-3]发现，选择性环氧化酶-2（cycloxy-genase-2，COX-2）抑制剂可抑制许多类型癌细胞的生长及诱导细胞凋亡，增强抗肿瘤药物对癌细胞的毒性作用。COX-2抑制剂的抗肿瘤活性的作用机制包括抑制细胞分裂周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成等。此外有研究[4-5]认为，COX-2抑制剂可以通过调节ABC转运家族中的膜转运蛋白活性而增强肿瘤对化疗药物的敏感性。研究[6]发现，在肿瘤组织内COX-2与P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达呈显著性正相关。本课题组前期研究[7-8]也证实，选择性COX-2抑制剂塞来昔布可显著增强顺铂对人舌癌细胞株Tca8113细胞的生长抑制作用，增加耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞内化疗药物的蓄积[9]。本实验研究塞来昔布对口腔上皮癌耐长春新碱细胞株KB/VCR化疗敏感性的影响，探讨塞来昔布增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 药物及试剂 　　长春新碱（Vincristine，VCR）（Merck公司，德国），塞来昔布胶囊（Pfizer公司，美国），MTT、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美国），RPMI-1640、胎牛血清（Invitrogen公司，美国），P-gp、Bcl-2、Bcl-XL及β-肌动蛋白鼠抗人单克隆抗体、荧光标记的羊抗鼠二抗（Epitomics公司，美国），人 　　口腔表皮样癌耐长春新碱细胞株KB/VCR、人口腔表皮样癌细胞KB、膜联蛋白（annexin）V-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）细胞凋亡检测试剂盒、Hoechst 33342/PI双染试剂盒（南京凯基生物 　　科技发展有限公司）。 　　1.2 细胞培养 　　KB/VCR细胞用含有10%胎牛血清和200 nmol·L-1 VCR的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%CO2环境中培养，KB细胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5%CO2环境中培养。 　　1.3 MTT法检测 　　将处于对数生长期的KB/VCR细胞，以每孔2×103个细胞的密度接种于96孔板中，常规培养24 h，细胞贴壁后分别加入含10 μmol·L-1塞来昔布（塞来昔布组）、1.5 μmol·L-1长春新碱（长春新碱组）、10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱（塞来昔布+长春新碱 　　组）及10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱+100 μg·L-1前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）（塞 　　来昔布+长春新碱+PGE2组）的培养基，终液量为每孔200 μL，另外以未添加药物的RPMI-1640培养基作为空白对照。继续培养24、48、72 h后，加入终质量浓度1 g·L-1的MTT溶液100 μL，继续培养4 h，弃上清后每孔加入150 μL DMSO，缓摇15 min，酶标仪（EL×800型，BioTek公司，美国）490 nm波长下检测光密度（optical density，OD）值。每孔设4个复孔，取其平均值，重复3