增殖诱导配体在多发性骨髓瘤中表达及临床意义.docVIP

增殖诱导配体在多发性骨髓瘤中表达及临床意义 　　[摘要] 目的 定量分析多发性骨髓瘤患者化疗前后外周血单个核细胞和血浆中增殖诱导配体（APRIL）mRNA及蛋白的表达水平。方法 应用酶联免疫吸附试验（ELISA）及实时荧光定量聚合酶链反应（RFQ-PCR）技术测定靶基因及靶蛋白的准确含量。 结果 MM患者化疗前APRIL mRNA及蛋白表达水平均显著高于正常对照（P 　　[关键词] 增殖诱导配体；多发性骨髓瘤；靶点；酶联免疫吸附试验 　　[中图分类号] R733.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）04-0011-03 　　多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种以骨髓中浆细胞恶性克隆性增殖为特征的B淋巴细胞恶性肿瘤，与骨髓基质细胞密切相关。其自分泌或旁分泌的可溶性细胞因子等瀑布式激活多发性骨髓瘤细胞胞内信号传导途径，同时可能增加的基质细胞分泌的细胞因子促进肿瘤细胞生成[1]。这些细胞因子中即包括增殖诱导配体（a proliferation-inducing ligand， APRIL），其为TNF家族新成员， 因具有促进肿瘤细胞增殖作用而命名，为幼稚、未成熟及活化B淋巴细胞的主要存活因子之一[2，3]。在多发性骨髓瘤细胞受外源性刺激激活的各种信号途径中，NF-кB 途径可能是最主要的途径之一。目前研究已证实，能直接激活NF-кB途径的APRIL，已经被确认是多发性骨髓瘤细胞的主要存活因子及生长因子，骨髓瘤细胞系及幼稚骨髓瘤细胞高表达APRIL及其体[1，4，5]。APRIL被发现具有保护MM、B-CLL细胞避免自发性凋亡及药物诱导性凋亡作用，同时可提高其细胞存活能力[6]。故目前认为，对APRIL的研究极有可能成为肿瘤，尤其是B淋巴细胞恶性肿瘤研究的新方向。 　　本研究采用ELISA及RFQ-PCR技术，测定不同分期MM首次就诊及应用一周期VAD方案化疗后患者外周血血浆中APRIL蛋白及单个核细胞中APRIL mRNA的表达情况，并归纳总结APRIL表达与MM不同分期及化疗前后间的关系，以期在MM早期诊断、早期治疗、预测疾病活动以及寻找预后生物参数等方面发挥重要作用，并为临床治疗新方法提供理论依据。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　62份标本均取自徐州医学院第二附属医院、南通大学附属医院、第二附属医院血液科2008年4月～2012年5月住院的31例初诊及一周期VAD方案化疗后患者外周血。其中男22例， 女9例，中位年龄65岁（46～82岁）。MM Ⅰ期6例，Ⅱ期9期，Ⅲ期16例，其中A组12例，B组19例。15份健康供者标本，中位年龄69岁（55～80岁）。MM分型、疗效标准及疾病诊断采用《血液病诊断及疗效标准》，由张之南主编。MM分期按国际分期系统（ISS）进行。 　　1.2 实验材料 　　限制性内切酶、T4 DNA连接酶； pGEM-T载体试剂盒；Trizol 试剂；X-gal、Taq DNA聚合酶；逆转录试剂盒（Qiagen公司）；DL-2000；胶回收试剂盒；ELISA试剂盒、核酸蛋白紫外分析仪、荧光定量PCR仪、全自动酶标仪。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1制备标本 取化疗前及后患者外周血6 mL，应用EDTA抗凝， 2 mL提取血浆，4 mL分离出单个核细胞。 　　1.3.2设计探针及引物 据注册号为NM012512的β2微球蛋白（β2M） 全序列（内参）和APRIL （注册号为AF04688 ），设计相应引物和荧光探针并合成。 　　1.3.3 构建增殖诱导配体（APRIL）及内参β2微球蛋白（β2M）标准品 细胞总RNA经Trizol法提取后检测其浓度和纯度，并进行逆转录反应， cDNA进行扩增目的片段，胶回收电泳PCR产物与T载体连接，连接产物经过蓝白斑试验筛选出重组质粒，提取出小量，阳性克隆经EcoRⅠ酶切鉴定、测序分析证实后进一步扩增，质粒抽提，再经核酸蛋白紫外分析仪定量，按倍比稀释后保存。 　　1.3.4 RFQ-PCR检测mRNA含量 在离心管中加入反应体系，并设5个APRIL或β2M标准品、空白管及阴性管各3个复孔作为对照。PCR 扩增在荧光定量检测仪中进行。由电脑软件计算出标本中β2M或APRIL mRNA值， 将APRIL与β2M mRNA比值定为评估APRIL mRNA表达水平的标值。 　　1.3.5 ELISA方法检测APRIL蛋白含量 严格按照说明书执行，测定靶蛋白含量。 　　1.4 统计学处理 　　采用Stata7.0统计学软件进行数据处理。数据以均数±标准差（x±s）表示，正常对照及MM患者化疗前不同分期、MM患者化疗后不同疗效APRIL mRNA和蛋白的表达比较均采用单因素方差