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人CYP2D6基因体外表达体系和功能研究方法建立 　　摘要根据GeneBank数据库中人CYP2D6基因构建表达载体pMA91CYP2D6，转化酵母细胞AH22在体外进行表达，抽提所表达的CYP2D6微粒体蛋白进行Western Blot验证表明表达成功.该微粒体蛋白与探针药物异喹胍反应，利用HPLC检测生成产物4羟基异喹胍，通过分析其得到酶动力学参数Km=10.14±0.94 μmol/L，最终建立起完整的人CYP2D6表达体系和功能研究方法，为未来测定CYP2D6各等位基因对应酶的活性，实现临床个性化用药奠定基础. 　　关键词CYP2D6；表达载体；微粒体蛋白；Km值 　　中图分类号Q786 文献标识码A 文章编2013 　　细胞色素P450（cytochromeP450，简称CYP450）是一类含有血红素亚基的蛋白超家族，参与内源性物质和包括药物在内的外源性物质的代谢，其代谢的药物比例占到总药物代谢的75%[1].CYP2D6属于CYP450超家族第Ⅱ亚型，代谢了药物总量的25%[2]，包括一些最为常见的临床用药，如抗抑郁类药物、抗精神疾病药物、抗心律失常药物以及肾上腺素阻断剂等[3]，这些药物反应通常为单加氧作用.CYP2D6基因是CYP450超家族中基因多态性最为显著的一类[4]，目前已经发现的CYP2D6等位基因超过100种（http：//www.CYPalleles.ki.se/）.其中某些等位基因会导致所产生的酶的活性与野生型相比有显著的变化（降低或升高），从而引起药物代谢速率不同，最终导致不同个体对于同一种药物的反应存在差异.这种差异性通常会导致两种不良后果，一方面会导致某些个体用药无效，而另一方面则会引起药物不良反应.在美国，每年由于药物不良反应引起的死亡高达10万例，并且导致超过5%的住院率[5].因此，建立CYP2D6体外表达体系，通过体外表达获得CYP2D6等位基因蛋白并且与相应药物进行反应来检测酶的活性，对于未来医生根据基因型检测结果来开具药方以减少药物不良反应并最终实现个性化用药具有重要的意义. 　　本实验根据Genebank数据库公布的野生型CYP2D6基因序列，使用之前已经构建好的野生型CYP2D6表达载体，电转化酵母细胞AH22，通过抽提微粒体蛋白，对蛋白表达情况进行分析，最后通过蛋白与药物异喹胍反应来检测是否有药物代谢产物生成并计算酶动力学参数Km值.本实验建立起了CYP2D6体外酵母表达体系和功能分析，为后续的CYP2D6等位基因对应酶活性的检测奠定了基础. 　　1材料与方法 　　1.1实验材料 　　1.1.1菌株和质粒Ecoli Top 10感受态细胞购自天根公司；pMA91质粒由Ellis S.W.博士的实验室惠赠，AH22细胞由本实验室保存. 　　1.1.2主要试剂及仪器 　　1） Pyrobest甲基化消化酶购自Takara公司；大肠杆菌质粒抽提试剂盒购自Omega公司；酵母质粒抽提试剂盒购自天根公司； 　　2） 琼脂糖、高氯酸购自国药集团有限公司；NADPH购自Promega公司；异喹胍、4羟基异喹胍、YPD培养基、CM培养基、色谱纯级KH2PO4购自Sigma公司；BDT、HiDi购自ABI公司. 　　1.1.3仪器与设备NaNoDrop2000分光光度仪（Thermo公司），Digital Sonifier超声破碎仪（Branson公司），Optima MAXE超速离心机（Beckman公司）；Model 680酶标仪（Biorad公司）；电转仪（Biorad公司）；隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；电泳仪（Biorad公司）；5804R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）. 　　1.2实验方法 　　1.2.1CYP2D6基因的克隆本实验中野生型CYP2D6基因的克隆质粒来自于Ellis S.W.博士的实验室，野生型CYP2D6序列通过酶切连接的方法插入到pMA91载体的Bgl Ⅱ酶切位点（图1）. 　　1.2.2CYP2D6基因测序验证为了验证构建的野生型CYP2D6质粒上酶切间的序列是否与GeneBank上的序列一致，在序列上游设计引物进行测序验证.引物为pMA91载体的通用引物P：5′AGAACCTCGTGAAACTTACA3′，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成.测序结果通过软件DNAMAN 3.1和Chromas 2.1进行结果分析和序列比对验证. 　　1.2.3酵母细胞的培养及电转化酵母细胞采用CM缺陷培养基进行培养，该培养基缺乏亮氨酸组分.由于pMA91载体本身可以表达亮氨酸，因此如果质粒转化成功则可以在CM筛选培养基中生长，达到筛选的目的.电转化之前准备好自己制备的AH2