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细菌纤维素高产菌株筛选和初步鉴定 　　摘要：通过静置富集和分离纯化等步骤从自然腐烂的水果中分离得到6株产细菌纤维素的菌株。从腐烂的芒果中筛选得到1株可产细菌纤维素的混合菌，混合菌产量为湿重617.3 g/L、干重23.9 g/L。经过分离纯化确定该混合菌中只有1株产细菌纤维素菌株M7，在传代培养过程中M7菌株细菌纤维素产量最高且稳定。对M7菌株进行形态特征、生理生化特征和16S rRNA分子序列分析，初步确定M7菌株为葡糖醋杆菌，16S rDNA分子序列已提交至GenBank，序列号为JX303335。 　　关键词：细菌纤维素；筛选；鉴定；葡糖醋杆菌属 　　中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3514-04 　　纤维素是自然界中含量最多的生物聚合物。植物纤维素含有半纤维素、木质素、果胶等杂质而影响了其使用的广泛性，工业上为了去除细胞壁中的木质素以获得纤维素，需要应用对环境有害的化学物质并且只能得到植物中50%的纤维素[1]。细菌纤维素是在1886年被首次报道的，它是由细菌产生的一种结构特点和力学特性不同于植物纤维素的纯度很高的纤维素[2]，它的优良特性弥补了植物纤维素的不足之处。细菌纤维素是由微生物合成的一种生物纳米材料，与植物纤维素相比，具有独特的三维网络结构和超细、纯度高、结晶度高、与水结合能力强和机械性能优良等特点，成功应用于很多领域，是当今国内外生物材料研究的热点之一[3]。由微生物产生的细菌纤维素产量低且生产成本高，很难应用于工业上的大规模生产，因此筛选出一种高产量的菌株至关重要。本试验以自然腐烂的水果为原料，筛选得到1株高产菌株M7，经过对M7菌株的形态特征、生理生化特征和16S rRNA分子序列分析初步鉴定为葡糖醋杆菌属。根据前人所做的研究结果[4，5]，本试验将菌株培养条件设置为30 ℃培养，pH 6.0，碳源为蔗糖。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器设备 　　VS-1300洁净工作台、SPX-250-Z型生化培养箱、HVE-50全自动灭菌器、VITEK-32全自动微生物鉴定仪、Bio-rad iCycler梯度PCR仪、G-130XHR凝胶成像系统、Eppendorf 5810R冷冻离心机、DM2500和DM4200显微镜、TIANGEN琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒等。 　　1.2 试验材料 　　1.2.1 菌种来源 芒果等19种自然腐烂的水果。 　　1.2.2 培养基 富集培养基（W/V）：5%蔗糖，0.5%酵母浸出粉，0.5%蛋白胨，0.5% K2HPO4·3H2O，0.5% Na2HPO4·12H2O，0.1%柠檬酸（C6H8O2·H2O），0.025% MgSO4·7H2O，pH 6.0；固体分离培养基（W/V）：3%蔗糖，0.5%酵母浸出粉，0.5%蛋白胨，0.5% K2HPO4·3H2O，0.5% Na2HPO4·12H2O，0.1%柠檬酸（C6H8O2·H2O），2%琼脂，pH 6.0；发酵培养基（W/V）和种子培养基（W/V）：成分与富集培养基相同；所用培养基和所用玻璃仪器在使用之前都要经过121 ℃灭菌20 min。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 样品处理 将腐烂的水果切碎后放置于小烧杯内，向烧杯中加入无菌生理盐水，使水面淹没水果，室温下振荡30 min，使水果上的细菌充分地溶入到生理盐水中[6]。 　　1.3.2 菌种分离 吸取10 mL浸泡过腐烂水果的生理盐水注入到90 mL富集培养基中，放在恒温培养箱中30 ℃条件下静置富集培养7 d。再吸取10 mL富集培养液于90 mL富集培养基中，如此富集继代分批培养[7]进行5次后，富集培养液表面依然有膜的再进行梯度稀释分离纯化。梯度稀释至10-15选取10-9～10-15的浓度各吸取100 μL稀释菌液，用无菌的玻璃珠涂布于固体分离培养基制成的平板上，放在恒温培养箱内30 ℃培养1 d。挑取平板上的单菌落接种于种子培养基上，160 r/min 30 ℃振荡活化培养24 h，以6%的接种量接种于发酵培养基上，30 ℃静置培养7 d，观察培养液表面有白色的膜生成的菌种即有可能是产纤维素菌株。 　　1.3.3 产物鉴定 取出培养液表面的膜，用去离子水冲洗3～5次，洗去表面杂质，放入5%的NaOH溶液中100 ℃处理2 h后，如果培养液表面的膜不分解则证明这种膜是细菌纤维素[2]，对应菌株就是可产细菌纤维素的菌株。 　　1.3.4 产量测定 取出纤维素膜后用去离子水冲洗3～5次，再用0.1 mol/L的NaOH溶液煮沸至纤维素膜呈透明或白色，去除其中的培养基和菌体即可，取出处理过的细菌纤维素膜后用去离子水冲洗纤维素膜至pH 7.0[8]。将纤维素膜铺平后测量膜