聚丙烯酰胺电泳与细胞培养..ppt

电穿孔法 把高浓度细胞短时暴露于高电压的电场时，通过电穿孔法可将待转染的DNA轰入细胞内。 高电压可使在细胞膜瞬时形成小孔，DNA可通过这些小孔进入细胞内并且与某些细胞的基因组结合。 就大多数细胞而言，电穿孔轰击后能有20－50％的细胞存活率就足以保证DNA的成功转染。 电穿孔通常在室温下进行，之后将细胞置于冰上，以延长细胞膜孔道的开放时间。 线性DNA稳定转染的效率比超螺旋DNA要高。 逆转录病毒DNA转染法 逆转录病毒载体是一种传染性病毒，含有RNA物质，可在体外介导非病毒基因进入分裂细胞，一旦感染细胞RNA则反转录产生DNA互补链，此DNA单链可以作为合成第二条DNA链的模板。 细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术 细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。 细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括核的移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。 杂交瘤技术是通过细胞融合产生特异杂交瘤细胞。 单克隆抗体制备过程 Western bloting 原理：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异的目的基因表达的蛋白成分 广泛应用于检测蛋白质水平的表达 步骤： 1、培养细胞蛋白质样品的制备： ?1）：胰酶酶解后裂解： ?　细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。 ?2）：皿上直接裂解： ?细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。 以上样品超声波破碎，加入beta-ME,溴酚蓝煮沸10min,5000rpm,离心，取上清，分装于-20℃保存。 注意： 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 ? 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 ? 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。 2、制胶：用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。 3、预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。 4、加样： 预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 5、 电泳： 加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时， 应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电 泳。 电泳常见的一些现象 1、 条带呈笑脸状：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 2、 条带呈皱眉状：装置不合适，特别可能凝胶与玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 3、托尾：样品溶解不好。 4、纵向条纹：样品中含有不溶性颗粒。 5、条带偏斜：电极不平衡或加样位置偏斜。 6、条带两边扩散：加样量过多。 6、转膜：半干式电转印 ? 1)Tris/甘氨酸-SDS结束后，取出凝胶; 2)将NC膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-10min; 3）按照顺序放置滤纸，凝胶和NC膜到半干槽中; 4)每层之间的气泡要全部去除。 目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 ddH2O清洗电极板，吸水纸揩干液滴； 戴手套，切6张滤纸与1张PVDF膜，与凝胶大小一致，并标记； NC膜在ddH2O漂洗５min,浸入电转移液中，注意驱除滤膜上的气泡； 在一浅托盘中加入少量的电转移液，把６张３MM滤纸浸泡于其中