Western-Blotting实验报告.doc

Western Blotting 本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。 Western Blotting的 blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。它通常分为两种方法： Western Blotting 方法一: 直接法 方法二: 间接法 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 1. 免特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 4. 可选择不同的Marker 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化 同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，主要有以下几种：i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。 一、实验原理 Western Blotting（蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质为抗原，与之对应的第一抗体发生免疫结合反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳分离的提议目的蛋白成分。蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测。? 连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分。 不连续系统：缓冲离子成分、 pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、 分子筛效应、浓缩效应区分。 SDS的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象： 在实验中要注意：印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢失和扩散。免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作容易，适用于理论和应用上的研究。 本实验采用人血清为材料，人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中 IgG占血清免疫球蛋白总量的75%～80%。人的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二硫键相连。在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。对此样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgG。 二、试剂，器材和实验材料 【试剂】 30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。 分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。 10％过硫酸铵(w/v)：临用前用蒸馏水配制。 10％SDS(w/v)。 10％TEMED。 电极缓冲液：甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。 样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％巯基乙醇，0.005％溴酚兰。 考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸。 脱色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。 TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/L Tris-HCl,