RP―HPLC法测定厦门市学龄前儿童CYP3A酶 活性色谱方案优化.docVIP

RP―HPLC法测定厦门市学龄前儿童CYP3A酶 活性色谱方案优化 　　【摘要】 目的：对RP-HPLC法测定厦门市学龄前儿童CYP3A酶活性的色谱方案进行优化，建立最佳色谱的分离条件。方法：利用氢化可的松（HC）探针法，以高效液相色谱法（HPLC）测定尿液中6β羟基氢化可的松（6β-OHC）、氢化可的松的浓度，解析高效液相色谱法分离人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松3种不同色谱方法。结果： 使用梯度洗脱法实验后得到的6β-羟基氢化可的松峰形尖锐且分离度较好。结论： HPLC测定6β-羟基氢化可的松和氢化可的松含量方法中梯度洗脱优于等度洗脱。 　　【关键词】 CYP3A；氢化可的松；6β-羟基氢化可的松；高效液相色谱法；梯度洗脱 　　【中图分类号】R917 【文献标识码】A 【文章编号】1003-8183（2013）11-0360-02 　　前言：药物代谢的主要场所是肝脏，肝脏进行生物转化则依赖于肝微粒体中的多种酶系，其中最重要的是细胞色素P4503A（CYP3A），该酶系基因的多态性对药物代谢的影响已得到证实[1-3]。氢化可的松是内源性的糖皮质激素，体内经CYP3A4 代谢为6β-羟基氢化可的松，人尿中6β-羟基氢化可的松和氢化可的松比值可作为理想的体内非损伤CYP3A酶探针，用以评价其活性。采用高效液相色谱法测定尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的含量，是目前较常用的一种方法[4-5]。但尿液中含有多种物质成分，给6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的分离带来一定困难。通过改变色谱条件，提高两种待测物质分离度。现将研究过程中所制定的各种色谱方案、改进思路做一介绍。 　　1 实验仪器和试药 　　1.1 实验仪器： Agilent1100 系列高效液相色谱仪；电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）；高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；漩涡混合器（海门市麒麟医用仪器厂）；氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）。 　　1.2 药品和试剂： 氢化可的松，6β-羟基氢化可的松（ （Sigma公司，批号SS170206，含量>98.7%）；地塞米松（中国药品生物制品检定所，批号100129-200804，含量>99.5%）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，均购置于上海化学试剂研究所；水为超纯水。 　　1.3 对照品和内标溶液： 精密称取6β-羟基氢化可的松和氢化可的松标准品各5mg，甲醇溶解并定容于5mL容量瓶，配制成1mg？mL-1储备液，置冰柜4℃保存，临用前用甲醇稀释成所需浓度的6β-羟基氢化可的松和氢化可的松标准品对照液。同法配制浓度为1mg？mL-1的内标储备液，临用前用甲醇稀释成所需浓度内标应用液。 　　2 实验方法 　　2.1 健康学龄前儿童尿样标本收集：收集厦门市学龄前健康儿童晨尿。在样品收集前2周内，儿童未服用任何药品、西柚等影响酶活性的药物和食物。留取晨尿-20℃冻存待测。 　　2.2 液-液萃取：取冻存尿样于40℃温水浴中解冻，取4mL尿样加入5mL锥形离心管10 000 r？min - 1离心10 min，取3mL上清尿液加入10mL具塞锥形离心管中，精确加入地塞米松内标液（20μg？L-1）15μL，再加入3mL乙酸乙酯提取液，漩涡提取3 min。吸取上层有机相2mL置于5mL锥形离心管中，在45～50 ℃水浴中以氮气流浓缩蒸干。残渣用100μL甲醇溶解，振荡混匀，吸取50μL进样。 　　2. 3 高效液相色谱法 　　2.3.1 色谱条件 色谱柱：日本岛津 Insertil ODS-3 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；检测波长240nm；柱温30℃；流速1mL？min- 1 ；流动相：水-乙腈，梯度洗脱。 　　2.3.2 洗脱方法 采用3种梯度洗脱方案，分别见表1；表2；表3 　　2.4 实验结果 　　2.4.1 表 1等度洗脱程序HPLC图谱 　　图1：尿样与标准品色谱图对比 　　如图1所示，尿样中内源性6β-羟基氢化可的松与内源成分未能分离，氢化可的松峰面积偏低。 　　2.4.2 表 2等度洗脱程序HPLC图谱 　　图2：尿样与标准品色谱图对比 　　如图2所示，尿样中氢化可的松的峰明显，但6β-羟基氢化可的松不能得到良好分离。 　　2.4.3 表 3梯度洗脱程序HPLC图谱 　　图3：尿样与标准品色谱图对比 　　如图3所示，6β-羟基氢化可的松分离度好，峰形尖锐。相比等度洗脱，使用梯度洗脱法时尿样中各成分分离度得到有效改善，且能获得较好的峰形；并能将检测时间控制在20min之内，有利于大样本检测。 　　3 讨论 　　本实验课题项目研究对象为学龄前儿童尿样，其中内源性成分复杂，通过前期的尿样萃取方法不能够完全