细胞迁移与检测技术.pptxVIP

细胞迁移和检测技术;恶性肿瘤基本特征;定义;◆肿瘤细胞的增殖 ◆肿瘤从原发灶脱离—E-钙粘连素下降 ◆肿瘤细胞的运动性和趋化性 ◆血管生成与肿瘤侵袭; 是恶性肿瘤细胞脱离原发部位，通过各种渠道转运到不连续的靶组织中继续增殖，形成同样性质肿瘤的过程。;人类对肿瘤侵袭转移的认识 肿瘤是高度异质性的细胞群体 转移是一个多步骤、序贯的复杂过程 转移的发生是多因素相互作用的结果 （Fidler,IJ Surgical Oncology Clinics of North America. 2001，10（2）：257-269）;肿瘤转移特点;2. 不同类型肿瘤其转移途径不同 淋巴道转移 癌 如肺癌、 NPC;3. 转移的器官特异性;;Transwell 小室;B. 有基质胶的Transwell小室制备BD公司的系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，37 ℃2h使基质胶水化。再吸去剩余培养液。;2．制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－5×105，不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。;3. 接种细胞① 取细胞悬液100－200μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200μl。② 24孔板下室一般加入500μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培???液的趋化作用就减弱. ③ 培养细胞：常规培养24h以内（主要依癌细胞侵袭能力及细胞倍增时间）;4 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法： A 直接计数法 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如图： ① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 ② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等 ③ 细胞计数：显微镜下进行拍照和计数，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。;B 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。 MTT法① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 24孔板中加入500μl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。③ 24孔板中加入500μl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。 0.1%结晶紫染色法， ①不需要固定细胞，直接染色即可。 ②染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来 ③洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。  ;划痕实验;体内实验;A: 将小鼠固定好,将尾巴拉直，绷紧; B:用酒精棉球擦拭尾巴,使血管扩张;选用适当的针头,在距尾尖1/4或1/3处进针，此处皮肤较薄，血管清晰，进针容易。 C:用左手的食指,中指,无名指及大拇指将小鼠尾巴固定, 手法：握住1ml注射器前面0.1ml处。右手小指搭在拽着鼠尾的左手拇指处 按此手形进针；看针尖前面那个斜面有3/4（关键），如果血管充盈则进1/2，进入，停，上挑针头，进针；左右轻摆动，如可动，可注射。 D:注射:注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，尾巴与桌边紧贴转弯处为进针部位。进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指接触处稍上方进针，一旦进入，须将针头稍稍上挑进入，针头沿血管进入，肉眼可关察到针头前进。如果针头在血管中前进，可明显地感觉到针行通畅，毫无阻力。 E：通过看有无回血来测试针是否在静脉内。 F：注射量为0.1-0.2ml/10g体重。 观察2-4周，可用荧光素或