马兜铃酸与NA相互作用的研讨.pdfVIP

摘要 马兜铃酸(Aristolochicacid，AA)是一种肾毒性物质，具有致癌 性及致突变性。马兜铃酸在体内或体外被代谢激活后，与DNA共价 变的主要机制。作为AA暴露的生物标志物，AA—DNA加合物的研究 具有非常重要的意义。然而，目前市场上尚无AA．DNA加合物的标 准品，开展对其深入研究技术上存在许多难点。因此非常有必要建立 一种方便、快捷制备AA—DNA加合物标准品的方法。 本论文采用体外化学活化法用AA直接与脱氧核苷反应合成 AA．DNA力I：I合物，进而用固相萃取进行样品前处理，采用液相色谱进 一步纯化，制备出了高纯度的AA．DNA)JI合物标准品(94％)。 dG．AAII)的色谱、质谱以及碎片形成模式进行了分析，为后续的 AA．DNA)JI合物的研究工作奠定了基础。 作为AA暴露的生物标志物，AA—DNA加合物的检测分析对于深 入研究AA的致癌及致突变性具有十分重要的意义。本论文发展了一 种高灵敏、高特异性地同时检测三种AA—DNA加合物(dA．A灿、 快速的分离，我们使用HALOC18柱，在25％乙腈条件下三种加合 物能够在5min内即得到完全的基线分离，在普通的液相色谱仪器上 得到超高效液相色谱(切，LC)的分离速度和效果，大大提高了复杂 产物的分离度。在优化得到的色谱及荧光检测条件下，三种加合物均 呈现出很好的线性相关性(踟．9980)，检测限分别是：dG．A触：11．75 fmol；dA．AAII：0．32fmol；dA．A甜：0．23fmol。此外，我们对三种 加合物的保留时间及峰面积进行了精密度考察，三种加合物均呈现出 良好的日内及日间精密度。 为了探讨马兜铃酸对机体的化学损伤机制，在国内外现有研究的 基础上，我们采用体外暴露的方式及发展的LC．FL法对经AA暴露 的小牛胸腺DNA及体外培养的人肺癌细胞DNA损伤作用进行了研 究。在AA暴露的CT-DNA中，三种加合物的水平分别是：dG．AAI： 9．5个加合物／103个正常碱基，dA．AAI：5．0个加合物／103个正常碱基， (A549)的损伤作用研究中，我们考察了A甜毒性作用的时间一效应 关系及剂量一效应关系，结果显示随着暴露时间的延长和暴露剂量的 增加，加合物的量成上升趋势。 综上所述，本论文发展的化学活化法合成、固相萃取纯化及液相 色谱制备加合物的方法具有简便、快捷的优点，能够得到纯度很高的 加合物标准品。而LC．FL方法检测AA．DNA加合物具有高灵敏、高 特异性以及重现性好的优点，为AA．DNA加合物的研究提供了一种 有力的手段，有望用于动物模型及人体内AA．DNA加合物的鉴定分 析，对于临床疾病的防治工作具有重要意义。 关键词马兜铃酸一DNAjJN合物，固相萃取，液相色谱一串联质谱法， 液相色谱一荧光法 ABSTRACT Aristolochic aknown and acid(AA)isnephrotoxinpotential canformcovalentDNAadducts corcmogen．which aftermetabolic activationinvivoandinvitro．Sincethe从DNAadductsstandardsore stillnot availableand tobe inindividual commercially requiredprepared laboratories． researcheson and comprehensive mutagenesis ofAAhavebeenrestricted．Inthis method carcinogenesis study．asimple for andcharacterizationofads