07 实验七 亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定目的蛋白质(GST、SDS-PAGE)_PPT课件.pptVIP

实验七亲和层析纯化和SDS鉴定目的蛋白质 实验目的 掌握GST亲和层析纯化目的蛋白的原理和实验方法（第一部分） 掌握SDS检测目的蛋白原理和方法（第二部分） 第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋白 亲和层析原理 生物大分子与配体特异非共价结合。 酶-底物或底物类似物（竞争性抑制剂） 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补序列（Oligo-dT） 亲和层析原理 GSH-Sepharose 4B GSH- Sepharose 4B GSH-Sepharose 4B 亲和层析流程 第一部分 实验步骤 一、细胞破碎 3600 mL诱导的菌液，离心分装到12只50 mL离心管，-20℃保存；（每个班用2管） 每管加30 mL PBS缓冲液，混匀； 超声3S，暂停5S，持续15 min； 4℃，10000 rpm，离心10 min； 取50 uL上清，作为纯化前的样品； 每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。 二、装GSH-Sepharose 4B柱 1. 清洗和装好层析柱，封闭出口； 2. 加入2 mL PBS； 3. 取1-2 mL GSH-Sepharose 4B，加入柱子中； 4. 打开柱子出口，使PBS缓慢流出。 注意：始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B 三、纯化目的蛋白 1. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 2. 将混合蛋白质溶液2-3 mL加到柱子中。 3. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4. 加入1.0 mL 洗脱液。 5. 用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集 0.2 mL（3-4滴），共收集5管。 6. 用5 mL PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7. SDS检测第2和3管中的目的蛋白。 四、SDS样品制备 1号：过柱前的蛋白溶液80 uL 2号：收集的蛋白溶液（2号管）80 uL 3号：收集的蛋白溶液（3号管）80 uL 1-3号分别加入20 uL 5×上样缓冲液，混匀后在沸水中加热3 min。 1 2 3 M 1 2 3 M 样品加30 uL Marker加10 uL 亲和层析试剂 PBS（pH 7.4）: NaCl（58.5）40 g；KCl（74.5）1.0 g； KH2PO4（136.09）1.2 g； Na2HPO4·12H2O （358.14）18.1 g； 加水定容到5000 mL。 亲和层析试剂 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）: Tris（121.14）6.055 g，溶于900 mL水，用HCl调pH到8.0，用水定容至1000 mL。 洗脱液: 还原型谷胱甘肽（307.32） 0.15366 g，溶于50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。 第二部分SDS检测目的蛋白质 实验目的 掌握SDS检测蛋白原理和方法 掌握垂直板电泳的实验方法 蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200 KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系： logMW=K-bm 实验原理 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。（电荷效应、分子筛效应） 不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。 （电荷效应、分子筛效应、浓缩效应） 1. 凝胶孔径的不连续性（2种孔径） 2. 缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。 浓缩效应 3. 电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。 浓缩效应 实验步骤 1. 洗净玻璃板，吹干，安装制胶器； 2. 制作12%分离胶。按下表顺序加试剂，混匀，加入 玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高； 3. 用1 mL蒸馏水封住液面，室温30 min，分离胶与水之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水； 4. 配制5%浓缩胶，混匀，加入玻璃板间，插入梳子，静置30 min； 12%分离胶 试剂名称 加液量 ddH2O 2.5 mL 30% Acr-Bis（29:1） 3.0 mL 1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8） 2.0 mL 10% SDS 75 uL