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水稻PR10a基因启动子克隆及其活性检测 　　摘 要：从水稻中克隆得到病程相关蛋白10a基因的启动子PR10aP，构建该启动子驱动的可溶性绿色荧光蛋白基因（smGFP）的植物表达载体p3300-PR10aP-GFP，并用农杆菌介导法将其导入烟草，检测转基因植株经水杨酸（SA）诱导前后GFP的表达水平。序列分析表明PR10aP长度为1182bp，与已经报道的序列存在4个碱基的差别，含已报道序列的顺式作用元件，如水杨酸相关的W-box、ACGT序列等，也有增强子as-a-like元件及CAAT、TATA等常见应答元件。PCR检测结果显示，成功地获得了转基因烟草，荧光检测表明启动子PR10aP在正常条件下不表现活性，而在水杨酸诱导下GFP表达，证明新获得的水稻病程相关蛋白10a的启动子PR10aP具有水杨酸诱导性。 　　关键词：水稻；病程相关蛋白10a 启动子；水杨酸；绿色荧光蛋白 　　中图分类号：S435.11 文献标识码：A 　　水稻是我国最重要的粮食作物之一，中国的水稻???积占总粮食面积的30%，但总产量却占粮食总产量的40%。中国是世界上最大的水稻生产国，常年稻谷总产量占世界稻谷总产量的39%以上。水稻不仅保证中国的粮食需求，而且在国民经济中占有重要地位。因此，选育出优良的水稻良种，直接决定着水稻产量和水稻的抗病性。转基因技术为水稻育种提供了新的育种技术。 　　启动子是植物基因表达的重要调控元件，启动子可分为组成型启动子和特异型启动子，组成型启动子如：来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、来源于玉米泛素基因的Pubi启动子、来源于水稻肌动蛋白的Pactin1启动子，其特点是组成型启动子启动其下游功能基因在植物的整个生长周期及各个器官中均有表达。特异型启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，组织特异性启动子是控制功能基因在植株特定部位表达，诱导型启动子是控制功能基因在植株发育的特定阶段或特定条件下表达。 　　在转基因植物的研究中，提高植物抗逆性是一个重要的研究方面，植物抗逆性可分为对生物胁迫的抗性和对非生物胁迫的抗性。在生物胁迫方面，植物一生中会受到病毒、细菌、真菌、昆虫等伤害，但其伤害往往不是伴随植物一生的，而是发生在植物生长的特定时期，由于组成型启动子驱动功能基因在植物整个生长周期表达，利用转基因技术提高植物对生物胁迫的伤害，如果利用组成型启动子就会造成了能量的浪费，同时也会影响植物自身的正常生长，所以，利用诱导型启动子就显得更适合。 　　植物在长期的进化过程中，形成了一套对生物胁迫的防卫体系[2]——系统获得性免疫，即植物在被病原体侵害或水杨酸诱导时，诱导合成出一系列病程相关（PR）蛋白[3]，如几丁质酶[]等，这些蛋白具有广谱的植物抗病作用。 　　本实验从水稻品种“吉农大858”中克隆了病程相关蛋白10a基因的启动子PR10aP，并构建了由其驱动的绿色荧光蛋白（GFP）植物表达载体，采用农杆菌Boletus介导转化法，得到再生烟草植株，通过水杨酸诱导试验证明新获得的PR10aP启动子具有水杨酸诱导条件下的特异启动功能，为该启动子的进一步利用奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 　　水稻品种“吉农大858”由吉林农业大学农学院提供；烟草保存于吉林省农科院生物技术实验室。 　　1.1.2 菌株和质粒 　　从福州晶泰生物技术有限公司购买了宿主菌（Escherichia coli）Trans1-T1，从上海科兴生物科技有限公司购买了pGM-T克隆试剂盒，在吉林省农科院生物技术实验室保存了根癌农杆菌（Agrobactium tu）EHA105及植物表达载体p3300-GFP。 　　1.1.3 试剂 　　从北京赛百盛生物工程公司购买了连接酶、限制性内切酶，从北京全式金生物工程公司购买了TransTaq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi） Taq酶，从成都福际生物技术有限公司购买了胶回收试剂盒。从加拿大MBI公司购买了分子量标准200bp ladder。 　　1.2 方法 　　1.2.1 克隆PR10a启动子片段并进行该片段的序列分析 　　模板选用水稻品种“吉农大858”基因组DNA，扩增用根据已发表的PR10a启动子序列（Genbank GQ487632.1）设计的引物。此引物序列为： 　　PR10aPF： 5-GCCCTACAGCAAATACACGTTCTTA-3 　　PR10aPR： 5-CACTGAAGATATAATCTAACTAG-3 　　PCR程序：94℃ 5min；94℃ 30s ，57.4℃ 30s，72 ℃ 90s ，32个循环；72℃10min。PCR产物纯化后连入克隆载体pGM-T，测