蛋白质分子设计简课件.ppt

第二章 蛋白质分子设计  Chapter two Protein Design ;引言;蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因: (1)蛋白质分子量非常大(10 000-1 000 000)，不能通过化学方法生产; (2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的; (3)专一性致使其应用范围受到影响。 ;蛋白质设计目前存在的问题 1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性 2、三级结构的确定性较差;计算机模拟;一、蛋白质分子设计的分类;（一）蛋白质分子设计的层次;（二）蛋白质分子设计的分类;二、蛋白质分子设计的原则; 蛋白质分子设计原理; 蛋白质分子设计原理;序列设计;溶菌酶结构;设计步骤;第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计;一、定位突变;（一）定位突变的设计目标及解决方法;Hartley等于1986年完成了一个设计目标及解决的办法 ：;（二）定位突变的种类;（三）定位突变的程序;2．找出对所要求的性质有重要影响的位置;3．预测突变体的结构;4．构建突变体，获得突变体蛋白;5．突变体蛋白质的检验;蛋白质中功能 残基的鉴定 ;1．根据结构信息确定残基的突变;2．突变方法鉴定突变功能残基;3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基;（五）定位突变的应用;T4噬菌体溶菌酶 ;;目的和意义 通过对MPH的结晶和三维结构的测定，研究MPH活性中心的结构，并通过定点突变及活性测定来验证，确定MPH的结构和功能的关系,为MPH的改性和利用提供科学的依据和良好的材料。 OPH是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对硫磷水解酶的广泛应用。;;1 The nucleotide sequence including mpd from Pseudomonas sp. WBC-3 2 Plesiomonas sp. M6的甲基对硫磷水解酶基因 匹配区为134~1866，Identities=1720 bp／1733 bp(99％) CDS: 331aa (398-1393bp) 3 Pseudomonas putida的甲基对硫磷降解蛋白基因 匹配区为168~1393，Identities=1025／1026(99％) CDS: 341aa (368-1393bp) 两个基因的CDS不一致，分别匹配于MPH的398，368-1393bp;;MPH与OPH的序列比对;MPH信号肽的分析预测：神经网算法;MPH信号肽的分析预测：马尔??夫算法; ;MPH的SDS分析;;硒代蛋氨酸MPH的表达纯化 在诱导表达时添加高浓度的与蛋氨酸有共同的合成途径的终产物赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸，以及与赖氨酸具有相互协同作用的苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸来抑制正常菌株中蛋氨酸的合成，迫使细菌利用培养基中外源添加的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸MPH。 由于硒代蛋氨酸不稳定而易发生氧化，因此在纯化时需要加快速度，并在缓冲液中添加还原剂以保持还原性环境，如5 mM ?-巯基乙醇。;甲基对硫磷水解酶（MPH）P1晶型的晶体;甲基对硫磷水解酶（MPH）P43212晶型的晶体;硒代蛋氨酸MPH的晶体;同源二聚体 每个亚基含有一个由两个二价金属离子组成的中心。 Ala 36 为MPH的N末端第一个氨基酸（不具有1-35个氨基酸序列的结构）。;a;a: The supposed leaving group subsite of the MPH; b: The leaving group subsite of the OPH;;甲基对硫磷水解酶中三个芳香族 氨基酸的功能研究;mpd基因表达载体的构建;W179F，W179A，F196W和F196A突变体基因的扩增;MPH及其突变体的表达菌株诱导表达产物的SDS分析;E.coli BL21(DE3)/pET5a-mpd表达产物的SDS分析;Enzyme ;;二、蛋白质分子拼接;英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验 (人源化抗体);单链抗体scFv结构; 单链抗体的linker改造; 单链抗体的改体模型;　　　　;; PCR扩增重链、轻链策略; PCR反应体系及反应条件; VH 和VL的PCR扩增结果 ; 菌落PCR重组子验证; 改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化 ; 改体抗体的ELISA初步测定;单链抗体 抗体： 是体液免疫应答的主要效应分子。 由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）组成。;单链抗体（scFv）： 抗体可变区的重链（VH）与轻