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基于量子点标记技术鸡新城疫病毒sFLISA检测技术研究 　　摘要：本研究建立了基于量子点的鸡新城疫病毒（NDV） sFLISA检测方法。该方法以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体、以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体、以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针。该方法与其它有关禽类病毒（产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒）无交叉反应，比血凝试验灵敏，为临床早期快速检测NDV提供了行之有效的方法。 　　关键词：鸡新城疫病毒（NDV）；量子点；双抗夹心荧光免疫分析（sFLISA） 　　中图分类号：S858.31文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0118-04 　　新城疫是由新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）引起的急性、高度接触性传染病，常呈败血症，主要特征是呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血，严重危及禽类养殖业的发展，现流行于世界各国[1～3]。新城疫被国际兽疫局（OIE）定为A类传染病，中国将其列为一类动物疫病[4]。 　　新城疫病毒的检测主要应用免疫方法（包括免疫传感技术、蛋白质芯片技术、胶体金免疫层析技术、免疫组化技术、免疫荧光技术等）和分子生物学技术（包括RT-PCR技术、基因芯片、液相芯片技术等）[5]。量子点（Quantum dots，QDs）是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料，与传统有机荧光染料相比，具有荧光稳定性高、吸收光谱宽、发射光谱窄而对称、衰减寿命长、生物相容性好等特点，已经成为病原检测的新工具[6～9]。 　　本研究以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体，以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针，建立了NDV sFLISA检测方法，为养殖业早期发现NDV感染提供了有力的工具。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　灭活新城疫病毒（NDV，HA效价为256）和阳性尿囊液病毒由本试验室保存。鸡产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、鸡新城疫病毒（La Sota株）国家参考品、抗鸡新城疫病毒阳性血清和鸡新城疫试验用阴性血清购自国家兽医微生物菌种保藏中心。 　　1.2主要试剂和抗体 　　兔抗NDV多克隆抗体（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；鼠抗NDV单克隆抗体（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；量子点标记的链霉亲和素-605（QS605，武汉珈源量子点技术开发有限公司）；包被液：0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）；洗涤液：0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS）；封闭液：1× BSA-PBS。 　　1.3主要仪器和器材 　　多功能荧光酶标仪（SpectraMax M5）；6930型冷冻离心机（日本KUBOTA公司）；5415R 微量冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；MS3涡流旋转振荡仪（德国IKA公司）；黑色底透的荧光酶标板（Thermofisher NUNC）；Eppendorf移液枪（0～200 μL、0～1000 μL，德国Eppendorf 公司）；冰箱[冷藏温度（4±1）℃，中国海尔]；恒温培养箱[（37±1）℃、（42±1）℃，日本SANYO]。 　　1.4尿囊液病毒的制备 　　4℃反复冻融尿囊液3次，然后3 000、5 000、8 000 r/min 各离心30 min，上清经100 000×g离心2 h，用少量 TEN 缓冲液将病毒沉淀悬浮，再用20%～60%的蔗糖溶液经密度梯度离心纯化，经100 000×g 离心8 h，收集40%～60%梯度层内的病毒带，用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 透析48 h，分装，于-20℃冻存备用。 　　1.5 sFLISA标准操作程序 　　sFLISA在NUNC酶标板反应微孔中完成，具体实验方法如图1所示。微孔板先用100 μL含有1.25 μg/mL的抗NDV多克隆抗体在4 ℃包被过夜（包被液：0.05 mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液）；洗涤液洗涤3次，200 μL/孔，每次3 min；用1×BSA-PBS封闭，300 μL/孔，37℃ 封闭2 h；洗涤液洗板3次后，加入待测样品，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入1∶200稀释的生物素标记NDV单克隆抗体，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入量子点标记的链霉亲和素荧光探针，37℃孵育1 h，洗板后晾干。阴性对照孔加阴性血清，空白对照孔加入100 μL PBS，通过荧光分光光度计测定其相对荧光强度。 　　1.6sFLISA工作条件的优化 　　1.6.1多抗包被浓度、生物素标记单克隆抗体稀释度的确定抗NDV多克隆抗体以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL等