凹凸棒土对黄曲霉毒素B1吸附率测定方法研究超高效液相色谱法.docVIP

凹凸棒土对黄曲霉毒素B1吸附率测定方法研究(超高效液相色谱法) 　　摘要：凹凸棒土具有较大的比表面积，且储量丰富，价格便宜，可作为黄曲霉毒素B1（AFB1）的吸附剂。根据毒素吸附剂在水溶液中与毒素充分混合能够吸附毒素的原理，本研究利用凹凸棒土与黄曲霉毒素B1的水溶液在37℃充分混合，然后离心检测上清液中的黄曲霉毒素B1毒素残留量，通过与空白对照进行比较，计算吸附剂对毒素的吸附率。 　　关键词：凹凸棒土 黄曲霉毒素B1 吸附率 超高效液相色谱 　　凹凸棒土呈纤维网状结构，比表面积大，含有多种动物所需的矿物元素。凹凸棒土粉作为混合饲料的添加剂，以其特有的物理性能，能促进动物机体的新陈代谢，提高饲料转化率，使动物食欲旺盛，皮毛丰润，增重快，出栏早，降低饲养成本。同时还具有优良的吸附性，能有效地吸除动物的大肠肝菌、生物毒素等，起到防疫治病、除虫杀菌的作用，并提供牲畜生长必要的微量元素。我市盱眙地区的凹凸棒土品位高、储量大，优质凹凸棒石粘土已探明储量在6700万吨以上，有用粘土总量达9亿吨。本文主要研究的是利用液相色谱法测定凹凸棒土对黄曲霉毒素B1的吸附率。本文参考国家标准GB/T 5009.23-2006[1]《 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》样品处理方法对黄曲霉毒素进行衍生化后利用液相色谱荧光检测器测定。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与试剂 　　凹凸棒土（江苏盱眙），黄曲霉毒素B1标准品（SIGMA）；正己烷、三氟乙酸、乙睛（色谱级）；Milli-Q 超纯水（美国Millipore） 　　1.2 仪器与设备 　　恒温摇床；高速离心机；分析天平；水浴锅；氮吹仪；涡旋混合仪； 　　高效液相色谱仪：Waters ACQUITY 超高效液相系统：四元低压梯度泵，自动进样器，荧光检测器； 　　1.3 实验步骤 　　1.3.1 标准溶液配制 　　黄曲霉毒素B1标准储备液（100 ug/ml）：准确称取黄曲霉毒素B1 0.0100g，用30%乙腈水溶液定容至100ml，振荡均匀后即得100 ug/ml的黄曲霉毒素B1标液； 　　黄曲霉毒素B1标标准使用液（1 ug/mL）：取100ug/mL黄曲霉毒素B1 1.00 mL，用30%乙腈水溶液定容至100 mL，振荡均匀后即得1 ug/ml的黄曲霉毒素B1标液； 　　将配置的1 μg/mL的标准溶液稀释成浓度为100μg/L的标准使用液，然后取8、40、80、160、400 μL，按样品处理方法处理后，用流动相定容到1.00 mL。浓度分别为0.8、4.0、8.0、16.0、40.0 μg/L。过0.45μm滤膜，待用。 　　1.3.2 色谱条件 　　色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （1.7μm ，2.1×50mm） 　　流动相：乙睛：水=20：80（v/v）流速：300μL/min； 　　柱温：35℃； 　　进样体积：5μL； 　　检测波长 Ex：365nm，Em：440nm； 　　1.3.3 样品处理 　　精确称取10-20 mg（称准至0.0002 g）凹凸棒土样品放入一个的耐热玻璃制的带螺帽的样品瓶振荡中，加入1.0 mL黄曲霉毒素B1标液（1 μg/mL），然后定量加入9.0 mL纯水。小心的将小瓶盖紧后将小瓶放入37 ℃恒温摇床中以150 rpm摇动处理90min。完成后将溶液在5000 rpm离心3 min，然后取上清液备用。同时按上述方法制备一个不添加凹凸棒土样品的空白对照。 　　根据上述离心上清液中黄曲霉毒素B1的实际含量取一定体积（200～400 μL）的样品溶液，在60 ℃下，用氮吹仪吹干。加入200 uL正己烷和100 uL三氟乙酸，在涡旋混合仪上混合均匀，然后在40℃水浴中衍生反应10 min。取出衍生后的样品溶液，在60 ℃下用氮气吹干，使用过滤后的流动相定容到1.00 ml，待测。 　　1.3.4 计算 　　×100 % 　　其中：R――??凸棒土对黄曲霉毒素B1的吸附率，%； 　　A――样品溶液中黄曲霉毒素B1的色谱峰面积； 　　A0――不加凹凸棒土空白对照溶液中黄曲霉毒素B1的色谱峰面积。 　　2 实验结果 　　2.1 标准曲线与线性范围 　　取不同水平的黄曲霉毒素B1标准溶液，按1.3.2节建立的仪器条件进行UPLC测定。计算不同标准水平下的峰面积，以黄曲霉毒素标准品水平/（μg/kg）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。直线几乎通过原点，故通过原点进行线性回归。标准曲线在0～40.0 μg/L 的进样水平范围内线性良好。线性方程及相关系数见表1。 　　表1 黄曲霉毒素B1的线性方程和相关系数 　　毒素 回归方程 相关系数r 　　黄曲霉毒素B1 Y=1