DNA纯度检测.docVIP

实验原理?DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（ug/ml）=50×OD260读数×稀释倍数。RNA（ug/ml）=40×OD260读数×稀释倍数。DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在.本实验室机器显示是OD260\OD230，则比值应在2-2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。实验步骤1. 将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中[pH8.O, 1Ommo1/L的Tris缓冲液,内含〈1mmol/L EDTA〉]或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。2. 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值：OD260/OD280，纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的此比值约为大于2.0。3. 根据：每毫升1微克的纯DNA的OD260值= 0.020，计算所得DNA的纯度；每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025，计算所得RNA的纯度；并讨论纯度较低的原因和解决办法。260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，只看OD260/OD280（Ratio，R）。DNA:? OD260/OD280比值应接近1.80，若R值大于1.8。说明存在RNA，可重新用RNaseA处理,酚:氯仿:异戊醇(23:24:1)抽提。若R值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化（也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。RNA: OD260/OD280比值在1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。当R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。注意事项1. 有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶/RNA酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制，RNA均用DEPC处理的水。3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。