FGF与Wnt通路.docxVIP

在软骨FGFR信号传递试验模型中，成纤维生长因子及经典Wnt/β联蛋白信号传递协同抑制软骨细胞分化ABSTRACT在骨骼发育不良中，异常的成纤维生长因子（FGF）信号传递干扰了软骨细胞分化，但其背后的机制仍不清楚。最近，人们发现软骨细胞中FGF通过Erk MAP激酶介导WNT共受体Lrp6磷酸化，从而激活了经典WNT/β联蛋白途径。本文中，我们探索了这种信号传递相互作用对细胞产生的作用。在小鼠肢芽微团块及肢体器官培养中，WNT增强了FGF介导的对软骨细胞分化的抑制，使得微团块培养中软骨结节的形成受到抑制，并且被培养的肢体生长受到抑制。FGF和WNT/β联蛋白途径同时激活引起软骨细胞外基质丢失，矿化组织特异性基因表达，细胞形状改变。WNT通过抑制基质合成并诱导生成涉及基质降解的那些蛋白激酶，从而增强了FGF对软骨细胞蛋白多糖和胶原性细胞外基质的下调。FGF与WNT协同诱导了调控RhoA GTPase通路的那些基因表达，而RhoA信号传递的抑制缓解了由FGF/WNT介导的软骨细胞形状的变化。我们的结果提示异常的FGF信号传递与WNT/β联蛋白协同抑制了软骨细胞的分化。INTRODUCTION软骨内骨化，即先前的软骨被骨质替换掉，是骨纵向生长的主要机制。骨在骺生长板处变得更长，而生长板处的软骨细胞经历了一系列分化阶段。软骨细胞离开其静息状态，呈柱状排列增殖，推出细胞周期并变得肥大，在这个过程中它们使其基质矿化，并开始凋亡。然后软骨就被骨质替换掉了（1）。FGF信号传递是这一过程的主要调控者之一。在小鼠中移除FGFR3会造成骨骼过度生长（2），而人类中FGFR3的活化突变与一些骨骼发育不良疾病有关，比如最常见的短肢侏儒症软骨发育不全（ACH），以及致死性发育不良（TD），它是最常见的致死性骨骼发育不良病。FGFR3相关性骨骼发育不良的标志性特征之一就是生长板结构的严重破坏，在TD中，这种破坏造成肥大软骨细胞柱变小，或根本就不存在（4）。这揭示了异常的FGF信号传递在软骨分化过程中的负性作用，但这种表型背后的机制仍不清楚。其中一个解释是FGFR3可能干扰了Indian Hedgehog（Ihh）/甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）信号传递，该信号传递对软骨细胞正确地从增殖状态转向肥大状态是必须的（5）。ACH和TD的小鼠模型的生长板中，都显示出Ihh和PTHrP信号传递成分表达受到抑制，而向培养的软骨细胞中加入PTHrP可以部分对抗由FGFR3调控的细胞表型（6~9）。我们认为，对于在TD中观察到的所有类型的软骨细胞分化缺陷，Ihh/PTHrP信号传递受损不是其唯一原因。其它可能介导FGFR3对软骨细胞分化作用的机制仍然有待描述，这妨碍了我们对FGFR3在骨骼生长中功能的完整理解。最近，我们描述了软骨细胞中经典（即依赖于β联蛋白的）WNT途径受FGF信号传递而激活，证据是FGF介导β联蛋白稳定化，其在细胞核中聚集程度增加，以及β联蛋白依赖性转录过程的活化。这一表型依赖于4个胞内PPPS/TP模体上Erk MAP激酶介导的WNT共受体Lrp6磷酸化，这4个模体是WNT/β联蛋白信号转导所必须的（10，11）。此外，FGFR3突变还与骨骼发育不良有关，表现出通过Erk/Lrp6途径的信号传递增加（12）。有趣的是，经典WNT配体出现在生长板软骨中，而其中WNT/β联蛋白途径的生理活化，通过抑制PTHrP信号传递并诱导终末分化软骨细胞特异性标志基因，促进了软骨细胞分化（12，14）。目前这项研究旨在探索FGF与WNT/β联蛋白信号传递之间的相互作用，对软骨细胞分化调控所产生的影响。RESULTS AND DISCUSSION软骨细胞中FGF激活了WNT/β联蛋白信号传递小鼠软骨瘤软骨细胞（RCS）是一种永生化的，表型稳定的细胞系，表达FGFR2和FGFR3，但不表达FGFR1和FGFR4，并产生大量的软骨样胞外基质（ECM），这种基质由硫酸蛋白多糖和Ⅱ型胶原组成（15~17）。通过添加外源性FGF2，活化RCS细胞中的FGFR信号传递，引起Lrp6在Ser1490和Thr1572处磷酸化（Fig.1A）（10），伴有β联蛋白累积，持续时间长达5天（Fig.1B）。我们在另外两个软骨发育模型中检测了FGF2介导的Lrp6磷酸化，这两个模型一个是E12小鼠肢芽间质细胞原代培养，通过微团块培养诱导向软骨细胞分化（18，19），另一个是从E17.5胚胎中游离的小鼠股骨肢体器官培养。这两个模型都对FGF2处理有反应，Lrp6磷酸化（Fig.1A）。Ser1490和Thr1572属于Lrp6上的PPPS/TP模体，该模体充当接纳位点，从β联蛋白破坏复合物中隔绝掉Axin1和GSK3，使β联蛋白稳定化并使转录活化（20）。移除PPPS/TP模体损伤WNT信