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白血病免疫分型中一些问题的讨论 流式的质控及仪器的调节 多色分析中的电压及荧光补偿的调节 使用BD公司的CaliBRATE3校准微球，包括unlabled,FITC,PE,PerCP，四种微球。BD用户使用FACSComp或Cellquest软件，COULTER用户使用SystemII或EXPO32TM ADC ，PARTEC用户使FlowMax均可用它来设定检测电压与荧光补偿。 使用BD试剂时，无需再为电压和补偿烦恼了 25TEST，每月校准一至二次 手头没有的话…… 手动调节电压与补偿方法： 1，用CD3/CD4/CD8三色试剂及正常人外周血来调节。 2，使用阳性样本用单色试剂逐个染色进行调节。 流式样本的制备 密度离心法（Ficoll），是否会丢失一些小群体白血病细胞？（有学者认为不会丢失） 好处：可以去除样本中的死细胞、红细胞、细胞碎片和其他不需要的细胞，如粒细胞。还适用于溶血失败的样本。 缺点：操作比较烦琐 CML样本较适于用密度离心法进行分离，因为其分离前后在流式散射光图并无变化，而正常骨髓则不出现粒细胞。 样本中死细胞的处理 样本中出现死细胞会有何影响? 使用Ficoll分离,去除死细胞 使用PI设门去除死细胞 制备样本前使用台盆蓝染色，如50%的单核细胞阳性则有必要去除死细胞 样本中的白细胞数量 过少时采用Ficoll分离单个核细胞(MNC) 过多时需要稀释样本 样本抗凝剂的选用 如果样本中出现凝块或出现溶血现象，对于流式来说仍可使用。前提要滤出凝块或用Ficoll分离。 常用抗凝剂可选用：肝素钠或锂（绿盖抗凝管），EDTA（紫盖），ACD（黄盖） 染色缓冲液 含2%的人血清的PBS（免疫球蛋白染色除外） 去除FC受体的非特异性结合 免疫球蛋白染色 要使用PBS将样本洗净，否则抗体会与游离的免疫球蛋白结合，而致使细胞表面染色假阴性。 目标细胞有限的样本 典型的如脑脊液或活检样本，需选用已知的异常抗原组合来识别异常细胞。 表面或胞浆内抗原染色 免疫组化只能在冰冻切片上识别细胞表面或膜内抗原 流式细胞仪可识别抗原来自细胞膜上或膜内，如： 胞浆IgM阳性为Pre-B 表面IgM阳性为成熟B 同时阳性则为过渡期的Pre-B 制备两管样本，其一染色表面，其二染色表面与膜内，两者之差可认为胞浆内有表达 间标试剂的使用 在白血病免疫分中一抗与二抗的使用有时不可避免。 在多色标记时使用间标技术需注意： （1）先对间标进行染色 （2）完全洗净多余二抗 （3）加入其他标记的抗体 染色在固定前或后 如无特异要求，免疫分型染色都在溶血固定前进行 固定后染色需注意：染色可能会包括胞浆内的抗原，如CD33、CD13 检测冷冻/解冻后的样本 检测冷冻/解冻样本在流式上毫无问题 使用冷冻缓冲液RPMI 或含高浓度胎牛血清的 Dulbeco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 含有粒细胞的样本（如AML细胞）冷冻时需高浓度FBS。解冻后的细胞仍可做生理学的实验，如P糖蛋白功能。 抗体的选择 免疫球蛋白抗体，必须用正常人血和病人血进行测试其有效性 CD19是检测B细胞肿瘤时理想的设门抗体，但当样本中存在正常B细胞或是浆细胞肿瘤时，可使用CD34或CD10设门，浆细胞则选用CD38进行设门。 抗体的CD分类 具有相同的CD分类的抗体可能会识别不同的位点，如CD79a抗体，不同的克隆号CD79a抗体可分别识别表面或胞浆内的抗原。 CD亚型抗体的选择使用，如CD15s，CD65s???? sialylated form of their respective carbohydrate antigens 设门单抗 设门单抗的目的是识别肿瘤细胞。常用CD45/SSC坐标来识别肿瘤细胞。但有时肿瘤细胞与正常细胞相互交错，而无法分离出肿瘤细胞 在对送检样本进行分析前，可以使用一小组抗体预检，来选取设门肿瘤细胞的最佳抗体。 当病人经人源化抗体治疗后，如CD20或CD33，此时便不能再选用这些抗体来设门肿瘤细胞了。 急性白血病中可使用CD34或CD117来选择异常细胞 通常在分析时最少需要获取300个异常细胞 设门浆细胞 无论设门正常还是异常浆细胞，可发现CD38强阳性表达。 当用CD38设门时，注意要恰当降低CD38的电压使强阳性群体显现。 在正式分析前，是否圈定了浆细胞要用CD138进行验证，浆细胞CD138阳性。 抗体的特异性 某些抗体对所识别的抗原缺乏特性异，如B27、P-gp。特别是B27抗体与众多的B座等位基因所表达的蛋白有交叉反应。使用前要获得相关资料来排除这些非特异性。 分析圈定的细胞 门内的细