实验十一蛋白质含量地测定.ppt 15页

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  • 2018-07-13 发布
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    实验十一蛋白质含量地测定

    实验十一 蛋白质含量的测定 一、目的要求 1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术 二、原理 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨,氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液,使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中,然后再用标准酸溶液进行滴定,滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol),根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右,所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25,便得到该样品的蛋白质含量。 Folin—酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—),因此有双缩脲反应,在碱性溶液中,能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上,引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂),蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂,生成蓝色物质。在一定条件下,蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍,较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外线的性质,吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内,蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系,可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定。 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律 ,因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高(比Lowry法灵敏4倍)。 三、 操作方法 1.标准曲线制作 取14支试管,分两组按下表平行操作。 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白含量(?g) 0 10 20 30 40 50 60 标准蛋白溶液(mL) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 待测蛋白质溶液(mL) 蒸馏水(mL) 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 考马斯亮蓝试剂(mL) 2.5 mL 摇匀,1 h内以0号试管为空白对照,在595nm处比色 OD595nm 以OD595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。 2. 未知样品蛋白质浓度的测定 测定方法同上,取合适的未知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内,根据所测定的OD595nm值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。 四.注意事项 (1)如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收,因为再这段时间内颜色最稳定。 (2)测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 五.思考题 (1)与其它测定蛋白质浓度的方法相比,考马斯亮蓝染色法测定有何优点? * * 总蛋白定量分析-BCA(Bicinchoninic acid,二辛可宁酸、二羧基二喹啉) ?准确灵敏:BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000μg/ml;Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml ?快速:45分钟内完成测定,比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 ?经济实用:除试管外,测定可在微孔板中进行,大大节约样品和试剂用量 ?不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 ?检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝 ?基本原理: 碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。 BCA蛋白质检测流程: Coomassie Dye-Based 蛋白质定量 PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH 2 CH 3 NH C CH 3 CH 3 N CH 2 SO

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    • 内容提供方:jyf123
    • 审核时间:2018-07-13
    • 审核编号:7036163006001140

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