实验十二质粒DNA的小量制备电泳检测与细菌转化.doc 8页

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  • 2018-07-13 发布

实验十二质粒DNA的小量制备电泳检测与细菌转化.doc

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    实验十二质粒DNA的小量制备电泳检测与细菌转化

    实验十二 质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化Ⅰ. 质粒DNA的小量制备一 实验目的学习并掌握质粒的小量制备技术。二 实验材料和用具菌种:E.coli DH5?/pUC19培养基:LB:Tryptone 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,pH7.2(Agar 2%);120℃灭菌20min。D0001碧云天质粒小量抽提试剂盒(或其它公司的产品)恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、 EP管(Eppendorf管,1.5ml微量离心管)、加样器、吸头等。三 原理实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。它是一种新型的离子交换柱,在特定的条件下,使质粒能在离心过柱的瞬间,结合到质粒纯化柱上,在一定条件下又能将质粒充分洗脱,从而实现质粒的快速纯化。而且在提取过程中,无需酚-氯仿抽提、无需酒精沉淀,可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。四 实验内容细菌培养及菌体的收获。用试剂盒进行小量质粒制备。五 实验步骤1. 将E.coli菌株接种到液体LB培养基中,加入氨苄青霉素至 100?g/ml,150rpm振荡16h;2. 吸取1.5ml培养菌液与1.5ml离心管中,13000rpm室温下离心2min。倒掉上清,然后倒置于吸水纸上,使液体流尽;3. 加入150?l溶液Ⅰ,vortex或弹起沉淀,使完全散开,无絮块。4. 加入200?l溶液Ⅱ,颠倒离心管6~8次,使细菌完全裂解,溶液透明,注意不能振荡;5. 加入500?l溶液Ⅲ,颠倒6~8次,可见白色絮状物产生;6. 13000rpm离心10min。离心时准备好质粒纯化柱及最后的质粒收集管;7. 直接将上清液倒入质粒纯化柱,13000rpm离心1min,使质粒结合于纯化柱上;8. 倒弃收集管内的液体,在质粒纯化柱内加入750?l溶液Ⅳ,13000rpm离心1min,洗去杂质;9. 倒弃收集管内液体,13000rpm离心1min,除去残留液体;10. 将质粒纯化柱放在质粒收集管上,加50ul溶液Ⅴ至管内柱面上,放置1min;11. 13000rpm离心1min,所得液体就是质粒。质粒于-20℃冰箱保藏备用。六 注意事项在使用前,在溶液Ⅳ(洗涤液)加入40ml无水乙醇或43ml95%乙醇,然后在瓶盖上作好记号。溶液Ⅱ在温度较低时,可能会产生沉淀,需先用水浴加热溶解,混匀后再使用。溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化,用完后应立即盖紧瓶盖。七 思考题加入溶液Ⅱ后,为什么不能剧烈振荡?附录一:pUC19图谱 Ⅱ. 质粒DNA的电泳检测一 实验目的学习并掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术。二 实验材料琼脂糖,TAE缓冲液,加样缓冲液,溴化乙锭(EB),标准分子量Marker电泳仪、稳压电源、凝胶电泳成像仪等三 实验原理 琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的有效方法。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度200bp~50kb的DNA.。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色,可确定DNA在凝胶中的位置。四 实验内容对所提取的质粒DNA样品进行电泳检测。五 实验步骤1. 制胶(见图3)(1) 胶模两端用胶带封严,架好梳子备用;(2) 称取0.2g的琼脂糖于100ml烧杯中,加入20mlTAE,加热熔化至无颗粒状琼脂糖,冷却到60℃左右加入EB(终浓度0.5?g/ml),摇匀,即倒入胶模中凝固30min以上;(3) 临用前,撕去封口胶带,放入电泳槽中,倒入适量的电泳缓冲液TAE(淹过胶面),拔取梳子备用。2. 样品准备取已提取好的质粒DNA 5?l于500?l指管中,加入1?l的加样缓冲液,混匀;3. 电泳(1) 将样品和5?l标准分子质量分别点样到梳孔中;(2) 恒压50v,电泳60分钟左右;(3) 电泳结束后关闭电源,取出凝胶,用凝胶成像仪进行摄影和记录。图3 灌制水平琼脂糖凝胶 六 实验结果 将质粒DNA条带与DNA MW Marker进行比对,对质粒提取结果进行分析。七 注意事项溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套,这些溶液经使用后应按下面介绍的方法进行净化处理。附录一溴化乙锭稀溶液的处理(适用于含有0.5?g/ml的溴化乙锭的电泳缓冲液)方法一每100ml溶液中加入2.9g Amberlite XAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂,可向Rohm & Haas公司购置;于室温放置12小时,不时摇动;用Whatman 1滤纸过滤溶液,丢弃滤液;用塑料袋封装滤纸和Amberlite 树脂,作为有害废物予以丢弃。方法二每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭;于室温放置1小时,不时摇

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    • 内容提供方:jyf123
    • 审核时间:2018-07-13
    • 审核编号:8034000006001115

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