抗原修复技术及其在免疫组化中的应用6.docVIP

抗原修复技术及其在免疫组化中的应用? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化学研究，经1991年shi等人[2]发展。抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施。本文的目的是概述AR-HIC的发展、应用和标准化。AR技术加热AR技术微波加热方法. 在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧(化)物酶，石蜡切片经蒸馏水冲洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用微波炉加热5或10分钟（注意防止切片干躁）。有时在加热5分钟后，间隔1分钟，再加热5分钟（在第一个5分钟后检测液体高度）。加热后，从微波炉取出塑料Coplin缸，冷却15分钟。片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟，才进行IHC染色。为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。微波（MW）加热过程如下：在专用盒内放入200ml柠檬酸缓冲液（PH6.0±0.1），并盖上带有小孔的盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，有作者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率800W[3]，微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(根据目前的研究,建议用医用微波炉)，中档继续处理10-20分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次3分钟。尽管有少数作者[4]认为经高温后冷却这一步省略。在我们观点，15分钟的冷却必须的几点理由：1、如这一步省略，对于有些抗体而言，会降低AR-IHC染色强度。2、突然从高温到低温可导致组织片掉片。3、可能引起形态学的变化。 单纯加热方法. ?将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉（600W）上加热至沸腾，并持续10min 。Shi等人[2]用单纯加热方法与微波加热方法比较IHC染色强度，显示两种方法导致相同的染色强度。 高压加热方法. ?Shin等人[5]发展了含水高压锅煮沸方法，来增强福尔马林固定的脑组织tau蛋白免疫反应性。将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续2min，压力锅离开热源，加热长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟，时间过长可能会使染色背景加深。现试剂公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法，这几年的实践表明，采取此方法可避免假阳、阴性，使IHC染色效果更佳。非加热AR技术 非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键，修复抗原。胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05％或0.1％PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可；或由迈新提供的0.125%的液体胰酶。将切片放入湿盒内37oC温箱中消化18-20分钟。 胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶；链霉蛋白酶消化法 . 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1％，消化时间20min。 抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。 总之,以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。