外源基因表达与基因工程药物课件.ppt

* * 真核细胞G-文库DNA中含有较多的重复序列与内含子（intron），结构基因只占一部分，从中筛选目的基因的 比率小、困难大，且长度长的基因也难以进行完整的 基因克隆。 而C-文库是指从真核细胞中分离纯化出所有mRNA，再以mRNA为模板反转录合成互补的cDNA，如此获得的cDNA片段与适当载体重组、导入宿主细胞，构建出cDNA文库，从中筛选目的基因。 在真核细胞细胞，平均一个目的基因所对应的 mRNA占总mRNA的10-4~10-3，而一个单拷贝基因只占基因组的10-7 ~10-5 ，相比之下前者比后者在含量上提高了2~3个数量级，便于提取。 * 体外重组DNA实验中，将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体(vector)，这也是一个DNA分子。所有的载体都是在实验室里加工制成的，在自然界里不存在现成的、可直接用于实验研究的载体。 * 美国斯坦福大学的伯格（P. Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S. Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。 * * 质粒的分子量一般为106~108 ，小型质粒的长度一般为1.5~15Kb。 遗传标志，如：抗生素的抗性基因，?-半乳糖苷酶基因（lac Z）等。 基因组文库（genomic library，G-文库） 是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。 cDNA文库（cDNA library，C-文库） 以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套的cDNA克隆集合。 如何从文库中获取目的基因？ 文库查询（screening）： 采用探针与文库中的重组DNA进行杂交反应 文库 重组DNA 探针 杂交信号 电泳后杂交反应检测 基因组文库特点： 含有基因组内全部基因片段（99％），是一个贮存基因组全部序列的信息库（含内含子等）； 真核细胞G-文库中含有较多的重复序列与内含子，一个单拷贝基因只占基因组的10-7～10-5 ； 具有种属特异性，但无组织特异性； cDNA文库特点： cDNA文库中，平均一个目的基因所对应的mRNA占总mRNA的10-4～10-3，相比之下后者比前者在含量上提高2～3个数量级，便于提取目的基因。 体现实时表达的信息，不包含全部遗传信息。 既有种属特异性，又有组织特异性； 载体（vector）：携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。 2. 按功能 克隆载体 表达载体 1. 按来源 质粒 噬菌体 病毒 人工染色体 （二）目的基因与表达载体的重组 病毒 (virus) 质粒 (plasmid) 噬菌体 (phage) 载体按功能分类: 克隆载体（cloning vector） 表达载体（expression vector） 克隆载体基本组成： ① 复制原点； ② 限制酶切位点； ③ 带有筛选标记； 表达载体还具有： ④ 表达调控元件 多克隆位点（multiple cloning sites, MCS）：一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列，以便不同来源的外源DNA片段插入载体。 1. 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) 识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的一类核酸内切酶，为原核生物所特有。 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类 基因工程技术中常用的是Ⅱ类 （分子剪刀），识别与切割位点序列特异，在识别序列内切割 DNA重组 工具酶 限制性核酸内切酶的发现 1970年， 第一个限制性核酸内切酶 定点剪切DNA 操作DNA 1978年， 获诺贝尔生理学或医学奖 限制性核酸内切酶——用于切割DNA Ⅱ类酶识别序列（4～6个碱基对）： —— 回文结构 (palindrome) 断裂磷酸二酯键，形成平端或粘端切口 平末端端或粘性末端（Cohesive/Sticky end） 2. DNA连接酶 一种封闭DNA链上缺口的酶，催化DNA链相邻的3’羟基与5’磷酸基团形成磷酸二酯键。 基因工程 “缝纫针” 基因重组 (gene recombination) 目的基因与载体分别经DNA限制性核酸内切酶切割，再通过DNA连接酶，将目的基因与载体以3’,5’-磷酸二酯键连接形成重组子（重组基因），也称DNA重组。 DNA重组 1972年， 世界上第一