常用作物生理指标测定的方法.docVIP

SOD,POD,CAT,MDA,可溶性蛋白用同一提取液。 磷酸缓冲液配制：A液（Na2HPO4 0.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到1000ml 浓度mol/l PH值 A液体积ml B液体积ml 定容体积ml 0.05 7.8 91.5 8.5 400 0.1 7.5 84 16 200 0.1 7.0 61 39 200 0.1 6.0 12.3 87.7 200 1/15 7.0 61 39 300 130mmol/l甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml 0.75mmol/l氮蓝四唑（NBT）溶液：称0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存 0.1mmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml 0.02mmol/l核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存 反应液组成 水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6 150ml反应液的组成是水12.7ml+磷酸（0.05MPH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.25ml+FD15.25ml SOD：称取0.g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8），冰浴研磨，研磨后再加入1ml缓冲液倒入离心管，平衡后低温（0-4℃）10000rpm离心后10min冷藏保存。取相同型号的试管，加入0μl上清液（2支对照管加缓冲液），分别加3ml反应液，其中一支对照放于暗处，其余在4000lux下反应20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再560nm下进行比色。 计算公式：SOD总活性（units.g-1FW）=(Ack-A)*V/Ack*0.5*W*a(V酶液总体积ml，w样品重=0.g，a测定是的酶液体积=0.0ml) POD：取上清液20μl加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每个1min读1次（读0，1，2，3min）的OD值。 反应液：0.1mol/L，PH=6.0的磷酸50ml加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器加热溶解，加入30%的H2O219μl存于冰箱内。 计算公式：POD总活性（△OD470/Min.gFW）=△OD470*V/a*W(V=4ml,a=0.02ml,W=0.5g) CAT：取上清液100μl加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每个1min再读一次（读第0，1min的OD值）。 反应液：0.1mol/L PH=7.0磷酸缓冲液20ml，加入0.1mol/LH2O2(5.68ml30%H2O2定容至1000ml)5ml。 计算公式：CAT总活性（△OD240/Min.gFW）=△OD240*V/a*W(V=4ml,a=0.1ml,W=0.5g) 数值下降。 MDA: 取上清液1ml(对照加1ml水），加2mlTBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000转下离心20min,取上清液于600nm,532nm,450nm下比色。 0.67%TBA：称0.67gTBA加少量1mol/LNAOH溶解，再用10%三氯乙酸定容100ml。 MDA(μg/gFW)=C*V/W=0.1548(D532-D600)+0.013D450(V=0.012L,W=0.5g) 可溶性蛋白：取上清液20μl（对照加水），加3ml考马斯亮蓝放置2min，立即于595nm比色。 G-250：称取100mgG-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%（v/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常温可保存一个月。 计算公式：蛋白质含量（mg/gFW）=3*Y*V/5*1000*a*W 标准曲线Y=143.15OD+3.6（生理组）或Y=143.56OD+1.28（园艺系） V酶液总体积=4ml,a=0.02ml,W=0.5g，3/5由于标线是5ml中的含量，而本方法用3ml，1000将μg变为mg) 可滴定酸：1.取一彩椒，称重，放入高速组织捣碎机内，加入等量水，捣碎 1～2min。每 2g 匀浆折算为 1g 试样。 2.称取25-50g，用无CO2水100ml，洗入250ml容量瓶，在80度水浴中30min，取出冷却，用无CO2水定容过滤。 3.取滤液50ml或100ml加入三角瓶中。加酚酞5-10d，用NaOH标