基因工程与体外表达课件.pptVIP

第八章 基因工程与体外表达;基因重组示意图;限制性核酸内切酶;一、限制性核酸内切酶; Ⅰ型酶具有限制和修饰作用。要求DNA分子上有特定的识别顺序，并在此识别位点下游100至1000bp处切割。 Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，有限制和修饰作用。但在识别位点附近切割DNA，但切点难以预测。 Ⅱ型酶并不兼有甲基化酶的活性。在DNA分子内部的识别特异位点并切割双链DNA，切割为点固定、已知，是基因克隆重常用的工具酶。;;;Bam HⅠ;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;二、其他常用的工具修饰酶;第二节 基因克隆的载体;（一）质粒 (plasmid)——存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子;质粒（plasmid） 在细胞内的复制分两种类型;克隆载体的的质粒应具备下列特点;;;（二）λ噬菌体(λphage);;;（三） 粘性质粒(cosmid);（四）M13噬菌体;;（五）病毒载体;酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）; 除具有克隆载体的性质外，还带有表达构件—转录和翻译所需的DNA序列。 （一）大肠杆菌表达载体 含复制起始位点、抗性基因、克隆位点，可以导入大肠杆菌。表达载体中含启动子、核糖体结合位点、克隆位点、转录终止信号。 1.启动子： trp-lac(tac)启动子：由trp启动子加上lac操纵子中的操纵基因、SD序列融合而成。 λ噬菌体PL启动子：一种温度诱导的启动子。 T7噬菌体启动子：表达效率很高的启动子。;2.核糖体结合位点：SD序列 3.转录终止序列;(二)真核表达载体;②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。;第三节 基因克隆的基本过程;一、目的基因的获取;（二）cDNA文库 将某一时间某一种类???胞中所有的cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为cDNA文库。 ;（三） PCR扩增特定基因 TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中 。;四、人工化学合成;二、载体的选择与制备;方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;平端连接 ;目的基因;在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;四、将重组体DNA分子导入宿主细胞;3、转染 指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 转染方法： 1、磷酸钙共沉淀法 2、电穿孔法 3、DEAE-葡聚糖法 4、脂质体介导基因转染 5、显微注射法;五、目的基因的筛选与鉴定;(插入失活法) 抗药性标记选择;组氨酸缺陷 型大肠杆菌; α 互补的检测 ;2、免疫学方法 利用特异性抗体检测表达产物;原位杂交;Southern印迹;4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定 5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA;第四节 真核细胞的转染;二、转染细胞的筛选;（二）药物筛选转染细胞;第五节 基因的改造;一、基因定点诱变技术;步骤：;2.含U模板法;3. PCR定点诱变法：高效定点诱变技术 原理：除合成所需的5’端和3’端常规引物（a，d）外，再合成一对带有诱变位点的互补寡核苷酸引物（b，c）。分别利用诱变引物b和5’端引物a，及诱变引物c和3’端引物d扩增出两个诱变的片段（a/b片段和c/d片段）。经去除扩增反应的剩余引物后，将扩增出两个诱变的片段等量混合、变性、退火，用DNA聚合酶Ⅰ大片段补齐。再利用5’端和3’端常规引物进行PCR扩增，得到定点诱变的DNA片段。;二、基因定点诱变技术的应用