射线晶体衍射技术应用于蛋白质晶体结构检测课件.pptxVIP

2018-7-25 1 X射线晶体衍射技术 在蛋白质晶体结构测定中的应用 2018-7-25 2 Definition of X-ray Diffraction X射线晶体结构分析是使用X射线作为物理工具，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种方法。 包含两个方面的内容：X射线和晶体。 2018-7-25 3 Introduction of X-ray Diffraction X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。 通过X-射线衍射法（X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。对晶体结构的研究将帮助人们从原子的水平上了解物质。 虽然，生物大分子X射线晶体学是揭示分子结构与功能的科学。但目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排列。 2018-7-25 4 X-ray发展历史 1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; 1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的距离和排列。因此获诺贝尔奖。 1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，α-构型的多肽链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用 NaCl 晶体 结构 2018-7-25 5 X-射线结构分析法（X-光衍射法） 工作原理： 由X-射线管产生的各种波长的X-射线，经过滤波器（如镍片等）得到一定波长的单色X-射线； 单色X-射线通过晶体，产生衍射线，用照相机记录下来，得到衍射图； 然后，通过对衍射斑点的位置与强度的测定与计算，并参照化学分析的结果，就可确定晶体结构。 2018-7-25 6 基本原理 根据晶体中原子重复出现的周期性结构。当X-射线穿过晶体的原子平面层时，只要原子层的距离d与入射角的X-射线波长λ、入射角θ之间的关系能满足布拉格(Bragg)方程式： 2d sinθ=nλ( n =±1,±2,±3,…) 则反射波可以互相叠加而产生衍射，形成复杂的衍射图谱。不同物质的晶体形成各自独特的X-射线衍射图。根据记录下来的衍射图谱，经过复杂的数学处理，可推知晶体中原子的分布和分子的空间结构。 2018-7-25 9 X射线晶体结构测定原理 晶体的衍射花样与晶体内部的结构有一定的关系，即衍射花样内衍射点的排列方式、点间距离的大小与晶体内生物大分子的排列方式和重复周期大小有关，而衍射点的强度分布与生物大分子结构本身的特点有关。 因此 通过分析衍射点的排列方式和测量点间距离的大小来推算分子在晶体结构中的排列方式和重复周期的大小 通过测量衍射点的强度，应用一系列数学方法，借助电子计算机可测定分子内每个原子在空间的坐标，从而测定整个分子的结构和晶体结构。 2018-7-25 10 晶体结构的基本知识 日常所见的许多晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子晶体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组相互平行的、情况相同的平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。 知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。 X-射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射图上斑点的位置与黑度。 衍射线方向：确定晶胞的大小和形状； 衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。 2018-7-25 11 测定步骤 培养大的、质量好的晶体 进行初步的x射线衍射分析； 重原子衍生物的制备； 衍射数据的测量和处理； 相位的计算； 电子密度图的计算和解释； 分子模型的修正。 2018-7-25 12 获得好的晶体是结构分析中最关键的一步 欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性(如，手性的一致性等)是能否获得完好结晶的关键之一。 重组DNA技术在这方面是一个很重要的突破。由高效表达克隆基因获得的蛋白质能够快速获得纯化，并且只需很少的纯化步骤就能得到均一的样品。 一般来说，一个蛋白质样品要想使其能结晶，至少需要97%的均一性。 2018-7-25 13 蛋白质晶体培养一般规律 蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程，即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。 通常认为形成晶体的过程需要： 一定大小的晶核 溶液达到过饱和 并保持一定的条件，使溶液中的分子失去自由运动的能量(平移、