转基因技术及应用课件.ppt

（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡 （厚约5mm）； （2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100?l为单元的小滴 数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)； （3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中； （4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥， 重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml； （5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口； （6）把待注射用的DNA装入注射管中； 2 DNA注射 （7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养 液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继 之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部； （8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵 细胞膜内(小鼠胚卵直径约10?m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原 核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注 射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射； 注射细胞数量越多越好； （9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待 注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种； （10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。 体内接种 （1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用； （2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液，排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)； 最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别； （3） 麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)； （4） 剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒； （5） 使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm； （6） 轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入 输卵管内； （7） 把输卵管及周围组织送回腹腔内； （8） 仔细紧密缝合创口， （9） 再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。 优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全 。 缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。 １ 转基因食品的安全性评价原则 IFBC提出采用判定树（decision-tree）的原则与方法对转基因食品进行安全性评价。 1)了解被评价食品的遗传学背景与基因改造方法； 2) 检测食品中可能存在的毒素； 3)进行毒理学实验。 FAO/WHO联合专家评议会制定的生物技术食品的安全性评价政策与原则着重强调： 1) 安全性评价应与科学为依据，不能过高估计该类食品的危害性，也不能过低估计该类食品可能存在的问题。 2) 任何生物技术食品的安全性评价应首先阐明其分子、生物学和化学特性。 3) 对基因改造微生物而制作的食品，如果其分子、生物和化学分析表明与传统食品一致，则主要对其杂质和加工过程进行评价，强调在加工过程中实施HACCP和GMP。 4) 对基因改造的动物性食品，动物本身的健康可作为安全性评价的标志。 5) 对已进行安全性评价并批准用于消费的食品，需进行有计划的使用后的人群健康监测。 ２ 转基因食品的安全性评价的方法 对转基因食品从营养与毒理学两方面按个案进行评价。在对一种转基因食品进行安全性评价时，应首先了解其背景资料，包括食品名称、来源（动物、植物或微生物）、基因改造方法（宿主、载体、插入基因、重组生产体的特性）、人体摄入量、使用目的及使用人群（是否是特殊人群，如孕妇、儿童等）、加工方法及食品成分等，同时确定待评价的试验样品与实际生产的和人类实际消费的食品是否一样。 1) SAFEST 1类食品：与传统食品极其相同或相似的基因改造