生物制药学第三章基因工程制药课件.pptVIP

第三章　　 基因工程制药 ;第一节 基因工程药物生产的基本过程;DNA重组药物制造的主要步骤;基因工程制药过程;上游主要程序;下游主要程序;;第二节 常用表达系统;一、大肠杆菌表达系统;;pBV220质粒;pET质粒;二、酵母表达系统;;;pYES2;pPIC9K;第三节 基因工程制药上游技术;一、目的基因的获得;2. PCR法 如果知道基因序列，且基因没有内含子，就可以通过合成引物，通过PCR的方法人工合成基因 3. 逆转录法 对有内含子的基因常采用的方法，具体工程为：提取细胞或组织的总RNA，用逆转录酶和OligodT合成cDNA的第一链，再通过PCR方法合成第二连 ;二、目的基因的克隆 ;三、基因的体外重组 ;四、重组产物转入到宿主菌中 ;五、外源基因的表达 ;六、目的蛋白的检测 ;第四节 基因工程制药上游过程实例;实例一 ;实例二 ;实例三 ;第五节 基因工程菌的稳定性 ;工程菌的不稳定性大多数是由于质粒不稳定造成的;一、工程菌的稳定性 质粒分裂的不稳定 :工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象 质粒结构的不稳定 : 指外源基因从质粒上丢失或者碱基重排、缺失而导致的工程菌性能的改变 ;1. 质粒不稳定产生的原因 ;2. 提高质粒稳定性的方法;两阶段培养法;发酵工艺条件的优化;选择合适的宿主菌或质粒;增大选择压力;固定化技术;第六节 重组蛋白高表达策略 ;一、大肠杆菌表达系统 ;外源基因的拷贝数;外源基因的表达效率;表达产物的稳定性;细胞的代谢负荷;发酵条件的优化 ;二、酵母表达系统 ;3. 外源蛋白的糖基化 4. 宿主菌的选择 1）生长力强 2）内源蛋白酶活性弱 3）菌株性能稳定 4）分泌能力强;5. 发酵条件的优化;工程菌表达药物蛋白，表达量越高越好？;; 高效表达的目的蛋白 无活性 无法有效复性 美国每年损失几十亿;第七节 包含体;;酵母表达系统————包含体？？？;一、减少包含体的策略 ;二、包含体的复性 ;三、包含体复性方法 ;第八节 分离纯化实例 ;基因工程表达一药物蛋白研究阶段和生产阶段分离纯化策略;重组类人胶原蛋白 ;胶原是结缔组织的结构蛋白 胶原蛋白是在提取胶原时，结构没有改变的一类蛋白 ;重组类人胶原蛋白是通过逆转录在人体中??取基因后，进行了某些位点的突变，并在大肠杆菌中表达的重组蛋白 分子量70，000 方法：亲和层析纯化 ;发酵后的工程菌，5000r/min离心30分钟 质液比1：6将菌体悬浮于细胞破碎缓冲液中（1mmol/LEDTA,5mmol/LTris） 冰水浴中超声波破碎仪间断超声十次，每次90秒;破碎液于4℃，5000r/min离心1小时，收集上清液 ;;沉淀溶解在缓冲溶液中（20 mmol/ LTris-HCl，pH8.0） 截流分子量30，000的超滤膜脱盐浓缩;脱盐的样品和平衡缓冲液（1mmol/LNaCl）1：1混合 层析柱用锌离子充分螯合，并用10倍体积的平衡缓冲液平衡 ;上样后，平衡液冲洗，挂柱 100 mmol/ L的NH4Cl洗脱 ;包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）;第十节 基因工程药物介绍 ;一、重组胰岛素 ;(a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有10～20％ (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80％以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。 (c) AB链同时表达法; 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。 根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 ;上个世纪50年代末期临床应用，从血液中直接提取 70年代，直接从供血的白细胞中直接提取 目前一般采用大肠杆菌表达系统生产 干扰素α可以明显地抑制胸腺癌、某些淋巴肿瘤和多发性骨髓瘤，还能抑制骨髓型肉瘤手术后肿瘤的复发 ;三、重组水蛭素