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腺病毒包装流程及操作 重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领 域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细 胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达 100% ，可全面超越其他病毒载体工具和脂质 体转染；对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb ）；不整合基因组；滴度高，操作方便。 因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。 目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒 5 型（Ad5 ），其基因组是36Kb 长的线性双链 DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber ）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从 内吞体（endosome ）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的 复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。 目前最常用的腺病毒包装体系有 AdEasy 和 AdMAX 两种，其共同特点是目的基因首 先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录 复制基因 E1 和 E3 的缺陷(ΔE1, ΔE3) ，其中E3 基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒 包装必需依赖表达 E1 的细胞系，例如 HEK-293 ，HEK-293A 等。 相对于 Adeasy 系统，AdMAX 系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。本操 作说明均基于 AdMAX 系统，该系统由 pHBAd 系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体 pBHGlox(delta)E1, 3Cre 双载体组成。 一、整体实验流程 二、实验材料 该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（pHBAd 系列，包括包括过表达、干 扰等类型）和骨架质粒（pBHGlox(delta)E1, 3Cre)。 1、载体信息（见附 1 ） 2、菌株：大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。 3、细胞株：293A ，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因E1 ，为贴壁依赖型成上皮样 细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为 DMEM+10% FBS+双抗（DMEM 完 全培养基）。293A 细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。 该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过 70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表 型。 若细胞密度持续在 70% 以下，则 293A 细胞能连续培养 3 ～4 个月维持原有的细胞特 性。若以购买得到的 293A 作为第一代，则 30 代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增 加，293A 细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现，我们需要在 初始阶段对细胞进行大量的冻存保种，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进 行冻存，可增加细胞复苏成活率。 注：为了达到最好的细胞状态，提高腺病毒出毒效率，推荐在培养基中加入汉恒生物的 SaveItTM 抗支 原体试剂。 三、腺病毒包装和浓缩 （一）质粒构建和扩增 构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提，浓度要求大于 1 g/l ， A260/280 在 1.7~1.8 范围内方可用于病毒包装。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的 大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。 注：质粒构建推荐使用汉恒生物 HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒。 （二）腺病毒包装 事先准备好用于包装病毒的 293A 细胞（50-70%的汇合度）和病毒质粒，转染每个直 径为 6 cm 的培养皿成分如下： pHBAd 系列穿梭质粒 2 μg pBHGlox(delta)E1, 3Cre 4 μg DMEM 需在 37℃水浴中预热，LipoFiterTM 转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使 用前摇匀。转染 6h 后置换成新鲜培养液。 注：1、LipoFiterTM 转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考 LipoFiterTM 说明书。 2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。 （三）病毒收集 病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常 在