医学总RNA提取定量与RTPCR 2011ppt课件.pptVIP

操作步骤 采用TaKaRa PrimeScript RT reagent kit进行cDNA第一链合成： 按下列组分配制RT反应液 5X PrimeScrip Buffer 2.0μl PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μl Oligo dT Primer (50 μ M) 0.5 μl Random 6mers (100 μ M) 0.5 μl Total RNA 6.5 μl 总体积 10?l 反转录反应条件如下 37℃ 15min （反转录反应） 85℃ 5sec （反转录酶失活反应） 注：反转录步骤在PCR仪中进行 第一链cDNA 2?l PerfectShot Taq 10?l 上游引物 (10?M) 1?l 下游引物 (10?M) 1?l RNase Free H2O 总体积 6?l 20?l 取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)： 如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 . PCR反应体系 /sfzx/ 腹腔热灌注化疗在腹膜假性黏液腺瘤治疗中应用肝功能异常时肠外营养中氨基酸的应用钢球磨煤机顶轴润滑油站系统讲解剖析高密隆运服务顾问和客服思想意识和基础汽车知识话术讲解流程培训高新技术企业与研发费加计扣除政策讲解苏州工业园区地方税务局 总RNA的提取、定量与RT-PCR 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学示范中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 目 的 实验流程 提取原理 操作步骤 逆转录原理 操作步骤 提 取 总RNA 定 量 合成cDNA 第一链 原理体系 引物选择 PCR 电泳原理 电泳步骤 电 泳 计算方法 操作步骤 第一部分 细胞总RNA的提取及定量Extraction and Quantitation of Cell Total RNA  所有RNA的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 关 键 点 原 理 10-5μg RNA/细胞 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍-有机溶剂法；氯化锂-尿素法；蛋白酶K-细胞质RNA提取法；异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(Trizol法)等。 目前常用的是Trizol法。 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% 原 理 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 其主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 在加入氯仿离心后，氯仿比重大，使溶液分为水相、中间层和有机相。RNA在上层水相中，DNA和蛋白质位于中间层，有颜色的下层为有机相。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。 原 理 RNA酶污染来源 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 常用的RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯?（DEPC) 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结