二章节菌扩大培养.ppt

二、啤酒酵母的扩大培养 一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。 1、实验室扩大培养 ? ? ? ? ? ? 三、 生产发酵罐的无菌接种 生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐；从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。 （1）从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种 通常有两种方式 由于微生物传代过程中不断产生变异，即遗传变异是绝对的，而稳定是相对的。菌株的优良性状不可能永久保持下去，即发生衰退（或退化）。这就需要通过创造适宜的环境来限制退化速度，并且要掌握如何让退化的菌种恢复其原来的优良性状（复壮）的方法。 第三节 菌种的衰退、复壮及保藏 衰退（退化）： 由于菌种的自发突变使其典型性状，特别是产量性状发生负变的现象。 一、菌种的衰退 引起菌种退化变异的因素： 遗传基因型的分离 丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离，这是数量遗传的自体调节现象。 自发变异的产生：负向变异为多数，结果：目的代谢产物产量下降，生长逐步变弱变慢，孢子形成能力低下等。 原因可能有：长期保藏；频繁传代（例：斜面保藏；发酵厂种子制备）；菌体在代谢过程中产生具有诱变作用的物质；存在增变 人工诱变导致的退化变异 一、菌种的衰退 衰退的防止： 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 选择良好的保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件。（保藏培养基、活化培养基） 采用不同类型的细胞进行接种 产孢子霉菌 细菌 一、菌种的衰退 复壮： 广义——是指在菌种的生产性状尚未衰退前，就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一种措施。 狭义——指菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有典型性状的一种措施。 二、菌种的复壮 复壮的方法通常有两种 纯种分离 淘汰已衰退的个体 二、菌种的复壮 菌落纯；用稀释平板法或平板划线法，取得单细胞菌落，再通过菌落的和菌的特征分析和性能测定，获得具有原来性状或性状更好的菌株。 菌株纯（细胞纯）: 只有菌丝的，在显微镜下用毛细管挑取只有一个核的菌； 有孢子的，在显微镜下用毛细管挑取单个孢子。 一般只要求达到菌落纯的水平——用于退化不太严重的情况。 1、纯种分离： 可通过物理、化学方法处理菌体（或孢子），使大部分死亡（80%以上），存活的菌多为生长健壮者，从中选出优良菌株。 用10%酒精处理，能耐之的一般为原菌株（啤酒酵母）。 在培养基内加青霉素，抗药性较强的细菌一般为原菌株（产抗生素）。 适当提高培养温度 加乳酸，淘汰酸奶菌种中的衰退个体。 一般可将单菌落分离与培养条件综合进行复壮，效果更好 2、淘汰已衰退的个体 根本目的是保持原有典型形状，防止退化、死亡及杂菌污染 途径：挑取其休眠体（分生孢子、芽孢），在其休眠后停止生长的条件下保藏。即缺乏营养、缺水、缺氧、低温等。 重要因素：低温 要求不损伤cell，缓慢冷冻易使cell死亡，快速不易死亡。 三、菌种保藏 适于98%以上各类别的微生物，但不适于不产孢子的丝状真菌的菌丝体 原理:在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止，为防止冷冻和水分升华中对细胞的损害，采用保护剂代替干燥中丢失的结合水而稳定细胞的构型。防止细胞膜因冻结而破坏，还可以起支撑作用，使微生物疏松的固定在上面。 （一）冻干保藏 步骤： 安瓿管准备 D=8mm，H=100mm的中性安瓿管，用2%HCL浸泡24小时→自来水冲净→蒸馏水洗1-2次→烘干→管口塞上棉塞→121℃，30分钟 保护剂制备： 脱脂牛乳或血清、乳糖、葡萄糖等（不含抗生素），蒸馏水配成17%-20%的脱脂乳（在无菌的干燥三角瓶中）→121℃,5min or 108℃,15min 杀菌（血清等用过滤除菌） （一）冻干保藏 菌种准备及分装 菌悬液的制备： 斜面（稳定期） 孢子（新鲜成熟）→每个斜面加2-3ml灭菌保护剂→用接种环将菌苔刮起（若液体培养，则应离心收集菌体，并经灭菌生理盐水洗涤，收集的菌体用保护剂制成菌悬液）制成菌悬液（109-1010CFU/mL）→用灭菌的滴管将菌悬液滴加至安瓿管底部，装量一般为球体的2/3左右位置（视干燥剂性能而定）→管口塞好灭菌棉 （一）冻干保藏 预冻：-70℃至全部冻结 冷冻干燥： 冷冻干燥器密封→开启降温至-50℃→开真空泵→冷干块或松散片状（1%-3%水分）