FasFasL与婴幼儿血管瘤演变过程的关联性研究.docVIP

FasFasL与婴幼儿血管瘤演变过程的关联性研究 　　[摘要]目的：研究（Fas/FasL自杀相关因子，factor associated suicide/factor as sociated suicide lire）表达在婴儿血管瘤演变过程中每个阶段的表达量并探求它们之间的关联性。方法：选取在笔者医院保存的婴幼儿血管瘤病例标本60例，并依据标本所处血管瘤病理形态将其分成六个阶段，采用EnVi sion免疫组化法和RT-PCR方法检测Fas和FasL蛋白及mRNA的表达情况。结果：Fas蛋白在增生早期和中期时有部分表达量，在增生晚期时阳性细胞增多并且Fas mRNA表达量达到最大，从消退早期至晚期，Fas表达量呈下降趋势；FasL蛋白从增生中期开始出现表达，当到增生晚期时FasL mRNA表达量最大且FasL蛋白表达量达到最大，从消退早期到晚期，FasL表?_量呈下降趋势。结论：Fas和FasL通过介导血管瘤细胞凋亡途径来使婴幼儿血管瘤自行消退，它们之间存在着密切联系。 　　[关键词]Fas；FasL；婴幼儿血管瘤；关系；演变 　　[中图分类号]R732.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）07-0060-03 　　婴幼儿血管瘤是一种常见的儿童期皮肤肿瘤，男女发病比例为1：（3～5），多发于婴幼儿头面部并表现为刚开始快速增长但后期增长减慢最终又会部分自行消退。近年来，业内对于婴幼儿血管瘤自行消退的机制一直为研究热点，有学者已指出细胞凋亡途径可能就是其自行消退的主要原因，而且细胞凋亡途径中主要通路就是Fas/FasL蛋白介导的死亡受体通路。本研究通过对60例婴幼儿血管瘤标本进行检测，研究其Fas和FasL蛋白及mRNA的表达情况并找出其中的关联性，现报道如下。 　　1资料和方法 　　1.1一般资料：选取2010年1月2016年12月在笔者单位住院的婴幼儿血管瘤标本60例，所有入选的标本患儿均为未经过治疗且单纯进行手术切除制备石蜡标本，患儿年龄2～120个月，依据患儿病理标本的形态将60例标本分成6份，分别为增生早期、中期和晚期及消退早期、中期和消退晚期。增生早期6例标本，患儿年龄2～3个月；增生中期8例标本，患儿年龄4～6个月；增生晚期16例标本，患儿年龄7～12个月；消退早期标本10例，患儿年龄12～36个月；消退中期8例标本，患儿年龄36～60个月；消退晚期标本12例，患儿年龄60个月以上，所有标本均是石蜡包埋。 　　1.2方法 　　1.2.1免疫组化染色所需试剂：抗Fas和抗FasL抗体（北京中杉生物技术有限公司），隶属兔源性多克隆抗体；二抗：羊抗兔多聚酶标二抗，辣根过氧化物酶标记。 　　1.2.2 RT-PCR所需试剂：Fas、FasL和β-ActinPCR引物设计序列，如表1所示。合成公司，中科院上海生物工程中心；PCR Ex Taq酶反应系统，日本TaKaRa公司；抽提RNA和逆转录试剂盒SuperScript 1T，美国Gibco公司。 　　1.2.3免疫组化染色方法：实验前将标本用机器制成病理切片，约为4um厚度。对其进行Envision法免疫组化染色，各个免疫组化染色指标用PBS液作为阴性对照，将细胞胞浆内或细胞外基质中出现棕黑色或棕黄色物定义为阳性，其余为阴性。 　　1.2.4 RT-PCR：将标本进行总RNA抽提并逆转录合成cDNA，用PCR仪进行扩增，条件是90s94℃-30s50℃-30s72℃，总共30个循环，最后5min延伸时间，将扩增后的溶液进行琼脂糖凝胶电泳并对凝胶图进行吸光度值分析，每个样品均检测3次，计算公式如下：mRMA表达相对量=目的基因片段条带的吸光度A值/同一样本β-Actin条带的吸光度A值。 　　2结果 　　2.1免疫组化染色：通过表1可以看出，Fas蛋白在增生早期和中期时有部分表达量，细胞饱满、致密，部分细胞有棕黄色染色，且阳性细胞数目增多，在增生晚期时阳性细胞增多，但从消退早期至晚期，Fas表达量呈下降趋势，且微血管内皮细胞仍有微弱阳性染色；FasL蛋白的表达从增生中期开始，呈现少数阳性细胞，有的阳性细胞位于血管壁中，直到增生晚期时FasL蛋白表达量达到最大表达，阳性细胞增多，且均在细胞密集之处；从消退早期到晚期，FasL表达量呈下降趋势，直至几乎看不见阳性细胞。 　　2.2 RT-PCR：通过对Fas和FasL蛋白mRNA的电泳图进行观察，可以发现Fas mRNA在增生早期和中期有一定量表达，在增生晚期达到最高，进入消退期开始下降，等到消退完成其几乎检测不到，FasL mRNA从增生中期开始有少量表达并在增生晚期表达到最高，进入消退期仍然很高但在消退完成期又几乎检测不到，通过进行吸光度值分析可发现Fas和FasL蛋