条石鲷促性腺激素基因的克隆 表达和性类固醇激素分析-cloning and expression of gonadotropin gene and analysis of sex steroid hormone in pagrosomus major.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 李军 中科院海洋所 研究员 主席 战文斌 中国海洋大学 教授 委员 王印庚 水科院黄海所 研究员 委员 姜国良 中国海洋大学 教授 委员 曲凌云 国家海洋局一所 研究员 委员 史宝 水科院黄海所 助理研究员 秘书 答辩地 点 黄海所一号楼三楼会 议室 答辩日期 2013.5.31 上海海 上海海洋大学硕士学位论文 条石鲷促性腺激素基因的克隆、表达和性类固醇激素分析 摘要 本文以人工培育的条石鲷（Oplegnathus fasciatus）为研究对象，运用 组织学、同源性克隆和 RACE 克隆法、放射免疫测定（RIA）法等技 术手段，对条石鲷卵巢各发育期特征、促性腺激素（Gonadotropin Hormone , GtH）和膜孕激素受体（membrane progestin receptor，mPRα） cDNA 全长的克隆、在组织表达特性和卵巢发育不同时期的表达特性、 血清中促性腺激素在繁殖周期中的变化规律等进行了研究，为深入认 识条石鲷生殖调控机制提供了理论支撑。本研究结果为全面揭示条石 鲷生殖调控机制以及繁殖调控研究提供了丰富的基础资料。相关结果 如下： .条石鲷促性腺激素 α（GtHα）亚基的克隆及其表达特性分析 采用同源性克隆和 cDNA 末端快速扩增（RACE）方法，从条石鲷 (Oplegnathidae fasciatus)垂体中获得了全长为 897bp 的 GtHα cDNA 序 列，其中包含 249bp 的 5’非编码区、399bp 的开放阅读框和 249bp 的 3’ 非编码区。其 ORF 编码 132 个氨基酸，前 38 个氨基酸为信号肽。肽 链中包括 10 个保守 Cys 残基和 2 个 N-糖基化位点，在第 122 和 124Cys 中间间隔了一个组氨酸（His），形成 CXC 型趋化因子的特征结构。此 外，在 3’端末端含有一个加尾信号 ATTAAA。其预测蛋白分子量为 14.59KDa，预测等电点为 8.41。氨基酸同源性和进化分析表明，条石 鲷 GtHα 与鲈形目鱼类的进化关系较近，与鲈鱼的同源性最高为 98%。 I 实时荧光定量 PCR 方法检测发现，GtHα mRNA 在脑、垂体、卵巢中 的表达量较高，在心、肝脏、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微量表达，在 脾脏、头肾、鳃、肾脏中不表达，其中在垂体中的表达量最高；周期 表达表明，垂体中 GtHα mRNA 在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值，卵巢 中 GtHα mRNA 在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值，而脑组织中 GtHα mRNA 在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。 .条石鲷促滤泡激素 β（FSHβ）亚基的克隆及其表达特性分析 采用同源性克隆和 RACE 方法从条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)垂体中 获得了全长为 554bp 的 FSHβ cDNA 序列。其中开放阅读框长 363bp， 编码了含 120 个氨基酸的蛋白，其中前 18 个氨基酸为信号肽。肽链中 含了 12 个保守的 Cys 残基和一个 N-糖基化位点（NIS），在第 255 和 第 257 半胱氨酸中间间隔了一个谷氨酸，形成 CXC 型趋化因子的特征 结构。此外，在 3’端含有一个加尾信号 AAATAA。其预测蛋白分子量 为 12.96KDa，预测等电点为 6.05。氨基酸同源性和进化分析表明，条 石鲷 FSHβ 与鲈形目鱼类的进化关系较近，与花鲈的同源性最高为 88%。 实时荧光定量 PCR 方法检测发现，FSHβ mRNA 在垂体、卵巢中的表 达量较高，在脑、心、肝脏、脾脏、鳃、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微 量表达，在头肾和肾脏中不表达，其中在垂体中的表达量最高；周期 表达表明，垂体中 FSHβ mRNA 在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值，而卵 巢和脑组织中 FSHβ mRNA 在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。 3.条石鲷促黄体激素 β（LHβ）亚基的克隆及其表达特性分析 II 采用同源性克隆和 RACE 方法克隆了条石鲷(Oplegnathidae fasciatus) LHβ cDNA 序列，并分析了 LHβ mRNA 在雌性条石鲷组织中的表达差 异和卵巢发育不同时期卵巢、垂体、脑中表达水平变化。结果表明， 条石鲷 LHβ 基因全长 857bp，其中 ORF 为 450bp，编码了 149 个氨基 酸，前 24 个氨基酸为信号肽，肽链中包含了 12 个保守的 Cys 残基和 一个 N-糖基化位点（NQT），在第 4 个 Cys 和第 5 个半 Cys 位点之间 存在着硬骨鱼类特异性的 Cys-Ser-Gly-His（CSGH）区域。此外，在 3’ 端含有一个加尾信号 AATAAA。其