藤梨根干预食管癌细胞ec9706cddppolβ的研究-study on the intervention of actinidia root on ec 9706 cddpph β of esophageal cancer cells.docxVIP

7 7 材料 与方法 l 实验材料 名称 PCR 仪 流式细胞仪 比色仪 高速台式离心机 高速冷冻离心机 |塌71式恒植培养箱 稳压恒流电泳仪 紫外分光光度仪 电泳槽 三用紫外月 凝胶成像系统 深低温怵箱 恒温振荡器 电热恒泪水槽 雪花制怵机 电子分析天平 TRIZOL ( RNA 提取剂) DEPC (焦碳酸二 乙醋) AMV (逆转录酶〉 Taq 酶 dNTP PCRMarker PCR 引物 随机六聚体引物 MTT 细胞培养液 RPMI-1640 0.25%腆蛋白酶 2 实验方法 2.1 Ec9706/cDDP 细胞的培养[ 4]  来源 美国 PE 公司 PE9600 型 美国 BECTOND ickinson 公 司 芬兰 KHB 公 司 上海安 亭科学 仪器厂 日本 HITACHI ，20PR-5 型 上海精宏有限公 司 ，ONP-9080 型 北京市六 一仪器 厂 DYY-8B 型 日本 HITA CHI，U-200 1 北京六 一仪器厂 北京新技术应用研究所 UV-III 美国 SYNOENE 日本三 洋 MDF-30 常州国化有限公司 ZD-85 型 上海精宏有限公 司 DK -8D 型 日本三 洋 SIM-FI24 BOSCH AE 200 OIBCO 公司 Sigma 公司 上海 Promega 上海 Promega 上海 Promega 大连宝生 物公司 上海生工 上海 生工 Amresco sangon 公 司 美国 Invitrogenlireteehnologies 公司 美国 HyClone 公司 Ec9706/cDDP 细胞系置于含 10% 胎牛血洁的 RPMI - 1640 培养基(节- 豆豆索 100u/mL.链霉素; 100u/mL ，谷氨M?主 110ug/mL)培养中加入 DDP(0.5μg/mL)3 7C ， 5%C02 饱和温度中培养 ，所有实验均在停用 DDP2 周培养后取细胞处于对数生长 期边，行。 2.2 藤梨根提取物置各 (5) 将藤梨根 1 kg 粉碎成粗粉 ，烘干备用。取藤 梨根 500 g ，力11入 3000 m L 正丁醉 中浸泡 12h; 回流提取 1h，过滤;药渣再加 2000mL 正丁醉回流提取 1h; 合并两 次滤液 ，减压回收正丁醉至稠怔状 ，真空干燥 : 干燥品 力11 蒸馆i水 500mL ，旋转加 热溶解，制成饱 和7.1洛液:灭菌;原液 (500mL. Ig/mL. PH=3.8) 。将原液稀释成 l 、5、10、100、 1000问/mL 五个药物浓度，过滤，灭菌，分装，置 4C 冰箱备用 。 2.3 MTT 法检测藤梨根提取物细胞 毒性作用(6) 方法略加改进，取对数生长期细胞，调细胞终浓度为 2 X 105/mL ，藤梨根提 取物作用浓度为 1、5、 10、100、1OOOl g/mL ，96 孔板每孔加入细胞 100L.再 用 RPMI-1640 加至总:w: 200μL ，设空白对照组，每种浓度均设 3 个平行复孔， 37 C ，5%C02饱和湿皮条件下培养 48h 后 ，每孔力n MTT (5g/L)2。此，继续培养仙， 平板离心机离 心， 弃上情液 ，镜下目测 MTT 蓝色结晶数 ，加DMSO (二甲基 亚 ij(l) 150μL 中止反应，振荡 10min 后，镜下见结晶完全溶解，比色仪测定 570nm 处l吸光度 (OD 值)，以OD 值直接 反应存活细胞数 量 ，据此可推测各浓度藤梨根提 取物对细胞的抑制率 ，找到无毒浓度进行逆转耐药试验。 抑制率(%)= (无药对照孔 OD 值 一 用药孔 OD 值) /无药对照 孔 OD 值 X 100% 2.4 耐药逆转试验 MTT 法检测(同前)，调细胞浓度为 2X10 /mL.设置 DDP 浓度为 l 、5 、10、 20 、40 、80问/mL ，分别力11 入实验组和对照组两组，其中实验组力 11 藤梨根提取物 10μg/mL ，同时设空白对照组 ，每种浓度设 3 个平行复孔。根据两组数据行在线回 归统计计算出各组半数抑制浓度 (IC50) ，计算逆转倍数 =对照 组 IC50 /试验组 IC50 。 2.5 RT-PCR 法检测 po 1 ? 的表达水平(7) 2.5.1 实验分组 : 细胞处理同前 ，取对数生长期细胞 106 个/mL ，实验分 2 组·① Ec9706/cDDP+ RPM I - 1640②Ec9706/cDDP +RA E( 1O lg/mL) ，每组设10 个样本 。 将以上各组细胞匀后分别种入培养瓶中，每瓶细胞数应注 1X 106 细胞。每瓶再加 入 R