45份菜用大黄SRAP标记引物筛选及亲缘关系分析.docVIP

45份菜用大黄SRAP标记引物筛选及亲缘关系分析 　　摘要：以45份引种的菜用大黄遗传背景未知为出?l点，利用已报道的相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，简称SRAP）引物，对这些引种材料进行遗传多样性分析，旨在阐明这些材料的亲缘关系。结果表明：在选用的182对引物组合中有42对引物扩增产物稳定、条带清晰、多态性较好，可以用作菜用大黄遗传多样性分析；利用42对引物对45份材料扩增后共获得230个等位基因位点，其中多态性位点202个，平均多态性位点比例达到878%。基于非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，简称UPGMA）的聚类分析结果表明：45份菜用大黄材料聚为7类，虽然来源地相同的大部分种群可以聚在同一个类群内，但种群间存在遗传交叉现象，揭示了种群间的亲缘关系，为这些引入材料的进一步利用提供了参考。 　　关键词：菜用大黄；SRAP分子标记；引物筛选；亲缘关系 　　中图分类号： S644.903文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0039-03 　　通信作者：赵一鹏，博士，教授，主要从事园艺植物种质资源与育种研究。E-mail：yzhao36@163.com。菜用大黄（Rheum rhaponticum L.）别称食用大黄、圆叶大黄、酸菜等，为蓼科（Polygonaceae）大黄属（Rheum）中以叶柄为蔬菜的栽培种，英文统称为Rhubarb。菜用大黄属于多年生草本植物，其叶柄具有粗大多汁、营养丰富、气味清新芬芳、风味独特、口感微酸等特点，是理想的芳香保健类蔬菜。在国外，菜用大黄被广泛用于制作馅饼、果酱、果冻、面包、蛋糕、沙拉、大黄果酒等各类甜品及加工成高级果蔬汁饮料[1-4]。 　　目前，国内对大黄属植物的研究和开发利用仅限于药用大黄相关资源，对菜用大黄的系统研究较少。2004年以来，河南科技学院菜用大黄引种及种质资源利用课题组赵一鹏博士在与国外合作的基础上，首次开展了菜用大黄优良种质资源的引种、组织培养技术[3-6]、栽培学特性及营养成分分析[7]、根尖染色体观察及核型分析[8]等研究，但关于菜用大黄起源、资源亲缘关系的研究尚未开展。本研究在进行了相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，简称SRAP）体系优化的基础上[9]，利用多态性高的42对引物组合对从国内外收集到的45份菜用大黄材料进行亲缘关系分析，旨在了解这些菜用大黄材料的遗传背景，为今后菜用大黄优良品种选育和分子生物学研究提供一定的技术支持。 　　1材料与方法 　　1.1 材料 　　用于引物筛选的菜用大黄材料为样本4号，种子来源于美国。用于亲缘关系分析的45份材料，采自河南科技学院菜用大黄资源圃，其中从美国引种材料13份，分别编号为1～13；从英国引种材料20份，分别编号为14～28、41～45；从北京引种材料12份，分别编号为29～40。于2016年4月上旬采集新鲜、无病虫害的叶片，用清水冲洗干净，置于-80 ℃冰箱中保存备用。 　　1.2方法 　　1.2.1模板DNA的提取及质量检测基因组DNA提取参照Liu等改良十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[10]，用Eppendorf核酸蛋白测定仪（德国）检测所提DNA的纯度及浓度，并用无菌ddH2O稀释至10 ng/μL，-20 ℃保存备用。 　　1.2.2SRAP-PCR引物的筛选SRAP-PCR扩增程序参照陈万胜等的方法[11]，即94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5个循环；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物于4 ℃保存备用。菜用大黄SRAP-PCR反应体系为笔者所在课题组郭小菲等已优化的体系[9]，即25μL体系中包含2.50 μL 10×PCR Buffer、30 ng模板DNA、2.50 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶，各0.50 μmol/L上下游引物，剩余体积用双蒸水补足。以上试剂均购自TaKaRa公司。引物序列参考Li等的报道[12-15]，共选用14条正向引物、13条反向引物（表1），可组合成182对引物。利用4号材料对上述引物进行筛选。依据电泳结果，选择扩增产物多态性丰富、条带清晰、重复性好的引物组合进行菜用大黄的亲缘关系研究。 　　1.2.3PCR扩增产物的检测扩增反应结束后，在产物中加入5 μL 6×Loading Buffer，混匀，取2.5 μL