ERK信号通路在癫痫大鼠海马中激活及托吡酯保护作用.docVIP

ERK信号通路在癫痫大鼠海马中激活及托吡酯保护作用 　　[摘要] 目的：采用氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠实验模型，研究急性致痫大鼠海马中ERK蛋白及下游NF-κB的活性改变，并观察托吡酯（TPM）的干预作用。方法:取健康wistar大鼠36只，随机分成5组，对照组，氯化锂-匹罗卡品处理组和三个剂量的TPM组。应用免疫印迹法检测海马组织中ERK蛋白磷酸化及下游NF-κB 蛋白表达的变化，并观察TPM干预后的行为学改变。结果：(1)急性癫痫发作后0.5h,除对照组外各组大鼠海马组织中磷酸化ERK及活化NF-κB水平均升高；（2）发作2.5h后，处理组大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平均下降，但仍高于正常水平；而TPM中剂量及高剂量干预组中大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平明显高于低剂量组及处理组结论：ERK通路在大鼠癫痫急性发作的海马体中能被激活，自发保护神经元细胞阻止凋亡，NF-кB参与此过程；而托吡酯能将激活的持续时间延长，激活的后续水平提高，这可能是TPM保护作用的重要机制。 　　关键词: 癫痫；ERK ； NF-κB； 托吡酯 　　中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1004-7484（2012）06-0100-03 　　 　　作为神经系统的常见疾病之一，癫痫在我国的发病率已超过7‰,目前研究表明，癫痫的发生于离子通道、神经胶质细胞及神经递质都有密切关系[1]。现有的药物已能在很大程度上控制癫痫的急性发作，但是癫痫反复发作后会造成一定程度脑损伤，导致神经元凋亡以及功能失调，尚不能完全解决[2]。托吡酯(TPM)是由氨基磺酸酯取代单糖的新型抗癫痫药物，能通过切断钠通道，提高GABA激活受体的频率。有研究表明，TPM还具有保护神经元作用，其机制尚未明确[3]。本实验通过复制急性癫痫大鼠模型，并通过观察癫痫大鼠行为学，探讨TPM的干预作用，最后通过免疫印迹法，观察ERK蛋白的磷酸化及下游NF-κB 蛋白表达的变化，进一步探讨TPM对神经元的保护作用的可能机制，为其临床应用提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验分组给药及癫痫模型的制备 　　健康清洁级成年wistar大鼠实验36只，雌雄不限，体重(200 ±30)g,实验分组见表1 　　组别 n 给药方式 　　对照组 5 腹腔注射5ml生理盐水 　　氯化锂―匹罗卡品组 　　(处理组) 6 腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品 　　 TPM低剂量组 7 腹腔注射TPM20 mg/kg， 　　1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品 　　TPM中剂量组 7 腹腔注射TPM40 mg/kg 　　1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品 　　TPM高剂量组 7 腹腔注射TPM80 mg/kg 　　1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品 　　1.2行为学观察 　　腹腔内注射后连续观察大鼠行为, 并记录癫痫发作的潜伏期、 发作程度和持续时间, 参考 Racine 分级标准[4]。 　　1.3 取材及核蛋白提取及蛋白样本制备 　　发作后0.5h，将中剂量TPM干预组中4只及处理组中3只大鼠予戊巴比妥钠 (80 mg/kg)深麻醉, 迅速断头、咬开颅骨、剥出双侧海马；发作后2.5h，照以上方法处死剩余动物并取材。 　　组织核蛋白提取试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，将组织匀浆后按试剂盒要求提取核蛋白。 　　1.4western blot检测ERK磷酸化水平和NF-κB 蛋白活化 　　用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，含5%脱脂奶粉的PBS封闭液封闭1h后加入一抗，4oc孵育过夜，洗膜后加入荧光素标记的二抗37oc孵育1h。采用GAPDH作为内参，用LI-COR Odyssey进行荧光显色并计算条带灰度值。实验均重复至少3次。 　　1.5 统计学处理 　　运用SPSS 10.0软件，进行单因素方差分析，显著性水平P0.05。 　　2 结果 　　TPM对氯化锂― 匹罗卡品诱导的大鼠行为学的影响 　　生理盐水组无癫痫发作；匹鲁卡品注射后15~18min后出现癫痫III ~I V级发作，6只大鼠出现强直阵挛，3~4h后发作停止；不同剂量TPM干预组的发作程度明显减轻，只在低剂量组有一只I V级发作。采用SPSS进行Ridit分析，匹鲁卡品组R=0.000，TPM低剂量组R=0.3180(P0.05),中剂量组R=0.4276(PO.O1),高剂量组R=0.3824（R0.05）,与匹鲁卡品组相比均有显著性意义。 　　2.2.1 wes