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不同裂解方式对微生物DNA提取的影响 　　摘要：分子生物学试验中的细胞裂解及DNA提取是试验的第1步，但是由于细胞种类多样、细胞壁成分复杂，DNA提取的效果容易受到提取方法的影响。针对以上问题，主要研究溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）等4种化学方法对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌3种代表性细菌细胞的裂解效果。结果表明：溶菌酶+SDS法对3种微生物的裂解效果都不错，但可能造成蛋白质污染且DNA碎片较多；溶菌酶+热冻法对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的裂解效果较好且蛋白质污染较少；蛋白酶K+CTAB法仅对金黄色葡萄球菌的裂解提取效果较好；溶菌酶+蛋白酶K法的提取效果最差。在试验中可以根据需要选择不同的裂解方式，从而达到操作性、重现性及经济性的统一。 　　关键词：微生物细胞裂解；DNA提取；溶菌酶法；混合法；热冻法 　　中图分类号： S182；Q933文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）12-0061-03 　　收稿日期：2015-10-22 　　[JP2]基金项目：水体污染控制与治理科技重大专项（编号：2014ZX07101-012-04）。 　　作者简介：凌云（1978―），男，浙江湖州人，博士，副教授，主要研究方向为微生物生态学。Tel：（021E-mail：yling@shou.edu.cn。 　　通信作者：彭自然，硕士，讲师，主要研究方向为环境化学。Tel：（021E-mail：zrpeng@shou.edu.cn。 　　由于细胞壁结构的不同，细菌可分为革兰氏阳性菌（G+）、革兰氏阴性菌（G-）[1]。革兰氏阳性菌的细胞壁主要成分是肽聚糖，其上附有磷壁酸；革兰氏阴性菌的细胞壁分为内壁层、外壁层，内壁层由肽聚糖组成，外壁层主要由脂多糖、蛋白质组成。细胞破碎的方法有很多[2]，有机械法（如珠磨法、高压匀浆法、超声波法）和非机械法（如溶酶法、渗透压冲击、干燥法、化学渗透法）。由于提取细胞内物质如DNA、RNA、活性物质等多数需要将细胞破碎，而机械法容易导致DNA断裂，因此相关报道更多地集中在使用有机溶剂、抗生素、表面活性剂、螯合剂、变性剂等化学试剂进行细胞破碎[3-5]。本试验以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌3种实验室常用细菌为研究对象，采用溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，简称CTAB）等4种常见化学试剂的不同组合对其细胞进行裂解，通过结合提取裂解后细胞破碎所释放出DNA的效果，比较这些方法对不同类型细菌的裂解效果，尝试寻找适合的方法，以期为细胞裂解及提取DNA的研究提供一定的参考。 　　1材料与方法 　　1.1试验菌株 　　试验所用菌株为笔者所在实验室中原有冷藏保存的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Bacillus coli）。 　　[HTK]1.2?验试剂[HT] 　　试验中所用到的主要试剂有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（简称Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，简称EDTA）、CTAB、SDS、NaCl、NaAc、蛋白酶K、溶菌酶、无水乙醇、溶菌酶、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇等。 　　1.3试验仪器 　　试验中所用的主要仪器：DNP-9052型电热恒温培养箱、DK-S22型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；RJ-TGL-16G台式离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；BioPhotometer生物分光光度计，德国艾本德（Eppendorf）股份公司；Biostep凝胶成像分析系统，德国Biostep公司。 　　1.4试验方法 　　将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于放有培养基并已灭菌的培养皿中，于25 ℃培养箱中培养24 h，并按相应方法裂解细菌细胞并提取DNA。所用培养基为上海疾控华康科技开发公司生产的营养琼脂，其主要成分为蛋白胨、牛肉膏粉、氯化钠、琼脂粉，pH值为7.3±0.2。 　　1.4.1方法1（溶菌酶+蛋白酶K法）参照刘晓侠等的方法[6]并稍作改动：将菌体用500 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0；1 mmol/L EDTA，pH值8.0）