不同树龄苹果园土壤微生物差异及对苹果砧木生长影响.docVIP

不同树龄苹果园土壤微生物的差异及对苹果砧木生长的影响 　　摘要：以平顶海棠(Mulus robusta Rehd)为试验材料，以4个不同树龄苹果园的土壤为对象。研究了不同树龄苹果园土壤对再植平顶海棠幼苗生长的影响。结果表明，在前茬树龄为3、8、15和24a苹果园土种植的平顶海棠幼苗比正茬土对照的平均株高分别减少31.22％、46.38％、57.66％和63.10％；再植平顶海棠幼苗地上部干质量分别减少0.96％、57.58％、76.88％和78.10％；地下部干质量分别减少40.38％、48.79％、64.03％和79.43％。在24a生苹果树土壤中再植海棠幼苗校正发病率达到了72.73％，而在3a生苹果树的土壤中再植海棠幼苗校正发病率只有18.18％。对不同树龄的苹果园土壤根际细菌和真菌群落结构的差异进行分析，其结果为，随着苹果树龄的提高，根际土壤中真菌种类和数量显著增加。而细菌的种类和数量则随着树龄的增加显著减少。 　　关键词：苹果再植病害；根际微生物；树龄；变性梯度凝胶电泳 　　中图分类号：S661.1　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)03-384-05 　　 　　据统计，2008年我国苹果种植面积为199.23万hm2，产量为2984.7万t，占世界苹果面积和产量的40％，居世界第1位。由于很多主产区大部分耕地都栽植了苹果，难以找到足够的耕地开展轮作，因此，再植问题严重困扰着我国苹果主产区果业的可持续发展。以河北省为例，本研究组在2007和2008年调查发现，树龄在15a以上的苹果园已占到近70％，而苹果最佳的结果年龄一般不超过20a，表明果园更新换代问题已经非常紧迫。苹果树再植病又称连作障碍或忌地现象，有的也叫再植障碍，得病植株表现为树势弱、叶片小、新梢细短、根系腐烂、根量减少、果实质量差等症状Ⅲ。再植病害病因复杂，但众多的研究报道认为，土壤微生物对果树再植病害的发生发挥着重要作用。 　　我们首先研究了随着苹果种植年限的延长，其根际土壤对于后茬再植平顶海棠幼苗的株高、生物量、发病率和病原真菌数量的影响，然后采用PCRDGGE技术。以不同树龄苹果园土壤样品中土壤微生物的基因组总DNA为研究对象。通过比较土壤中原核微生物的16SrDNA和真核微生物的18SrDNA差异，研究了随着苹果树龄的增加土壤中微生物群落多样性的变化情况。研究为明确苹果种植年限延长对土壤微生物区系及对后茬果树的影响提供了理论基础，为阐释苹果再植病害的发生机理提供了理论依据。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　白色塑料花盆(10cm×12cm)；海棠品种：平顶海棠(Mdus robusta Rehd)。 　　 　　1.2　育苗 　　海棠种子用1％次氯酸钠表面消毒5min，然后在自来水下冲洗5min。4℃湿沙层积处理30d以上，待种子露白后播种于灭菌的泥煤苔和珍珠岩混合基质上，定时浇灌Hoagland营养液(pH6.0±0.2)。置于培养温度(24±1)℃，12h光照的培养室中生长。 　　 　　1.3　土样采集和处理设置 　　土壤采集于河北省清苑县温仁村红富士苹果园，采集果园的树龄分别为3、8、15和24a。砧木为八棱海棠(M.micromcdus Makino)，土壤类型为黄褐土。对照土采集于苹果园附近未种植过果树的麦田。果园土样采集距苹果树干1.5m，深10-30cm的根际土壤，5点随机取样，混匀、过筛，备用。对不同树龄果园土壤的肥力进行测定(表1)。将不同树龄苹果园土壤及对照土壤分装于直径12cm花盆中，每盆装土1kg。将在培养室中培养4周的平顶海棠幼苗移栽于不同处理的花盆中。每个处理4次重复，每6株幼苗作为一个重复。 　　 　　 　　 　　 　　1.4　土壤微生物总DNA提取和PCR扩增 　　1.4.1　土壤微生物总DNA提取和纯化　采用化学裂解法，称取5g根际土壤样品，按照化学裂解法的试验步骤进行土壤微生物总DNA的提取。为了避免土壤样品所含腐殖质杂质对PCR扩增反应的抑制作用，对土壤样品的基因组DNA粗提液进行了纯化。采用Takara公司凝胶试剂盒对5种土壤样品的基因组DNA粗提液进行纯化。 　　1.4.2　DNA样品的PCR扩增　试验用引物参照文献，引物序列见表2。真菌与细菌PCR反应体系(50μL)：10×PCR缓冲液，0.2mmol?L-1dNTP，1.5mmol?L-1MgCl2，上下游引物各0.4μmol?L-1，模板DNA2μL，Taq DNA聚合酶2.5U，补充ddH2O至终体积50μL。 　　真菌普通PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min