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叠氮钠对小麦叶片DNA损伤的彗星实验 　　摘要：以小麦（Triticum aestivum Linn.）为材料，以不同浓度梯度的叠氮钠溶液处理小麦叶片后，采用彗星实验研究叠氮钠对小麦的遗传损伤。结果表明，叠氮钠能引起小麦基因的损伤，并随浓度的增加伤害程度加大，表明叠氮钠有明显的遗传损伤毒性，彗星实验可以利用植物细胞快速检测环境中对遗传物质有毒性的物质，是一种快速、简单、直接检测DNA损伤的手段。 　　关键词：彗星实验；叠氮钠；小麦（Triticum aestivum Linn.）；遗传损伤 　　中图分类号：X173；S512.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1502-03 　　目前，致突变物的检测是环境监测的重要内容之一。过去大量采用微核试验、染色体断裂和Ames实验，但是这些方法都是在大量烦琐试验的基础上建立起来的，且花费高，不利于广泛采用[1]。彗星实验（Comet assay）又称为单细胞凝胶电泳（Single cellgel elelectrophoresis，SCGE），最早由Ostling等[2]提出。彗星实验可以定量检测真核细胞中的多种DNA损伤，如单、双链断裂，碱性不稳定位点，不完全切除修复位点和DNA交联等[3]。在之前的研究中，彗星实验多是利用动物细胞DNA的损伤检测环境污染物质的致突变性和基因毒性，直到1996年Koppen等[4]第一次报道了利用植物为材料进行彗星实验检测环境污染物质对基因的损伤。此后不断有人利用植物彗星实验进行环境致突变物的检测[5]，表明植物彗星实验和动物细胞彗星实验一样可靠，提供了环境污染检测的一种手段，但是对叠氮钠遗传损伤研究以微核居多，尚未有文献应用叠氮钠进行彗星实验研究其毒性。本研究以小麦（Triticum aestivum Linn.）为材料，应用植物彗星实验技术初步研究了叠氮钠对小麦叶片细胞DNA的损伤，以期为慧星实验进一步应用于植物基因毒性检测提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 材料 小麦品种由南阳师范学院生命科学与技术学院遗传学实验室提供。 　　1.1.2 药品 叠氮钠（NaN3）、无水乙醇、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）、乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）、重铬酸钾（K2Cr2O7）、溴化乙锭（EB）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二甲基亚砜（DMSO）、正常熔点琼脂糖（NMA）、低熔点琼脂糖（LMA）、TrtionX-100、纤维素酶、果胶酶、去离子水等。 　　1.1.3 主要仪器 Nikon荧光显微镜（中英昆虫生物学联合实验室提供）、DYY-8C电泳仪、单面磨砂载玻片、盖玻片（24 mm×50 mm）、移液枪及枪头（各种规格）、离心管（各种规格）、恒温水浴锅、恒温培养箱、手动计数器、玻璃培养皿、烧杯、锥形瓶、玻璃棒、容量瓶、剪刀、纱布、滤纸、冰箱、吹风机等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 小麦叶片的处理和细胞核分离 采用去离子水无污染基质培养的小麦叶片，将其下端浸入浓度0（CK，用0.1 mol/L、PH 6.8的磷酸缓冲液浸泡）、100、500、1 000、2 000 mg/mL的NaN3溶液，于黑暗中25 ℃下处理4 h或过夜。处理结束后，取出叶片置于已在冰上预冷的无菌玻璃培养皿中。为避免光线对结果的影响，所有操作均在暗光或红光灯下进行。叶片冷冻10 min后采用机械分离的方法获得细胞核[6，7]，向培养皿加入一定体积的磷酸缓冲液，用无菌刀片在该缓冲液中轻轻将小麦叶片顺叶脉切开并轻轻转动培养皿，收集冲洗液于无菌的1.5 mL离心管中，加入2%纤维素酶和果胶酶溶液在55～65 ℃下反应约5 min，使叶片细胞核进入缓冲液获得细胞核悬液[8]。 　　1.2.2 电泳胶板制作 大多数实验常用“三明治”型3层凝胶结构，但有文献指出3层凝胶结构容易脱落[9]，经多次预实验，本实验采用2层凝胶结构。第一层为正常熔点的琼脂糖，第二层是低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合层。先制备第一层琼脂糖，将用95%乙醇浸泡过夜的单面磨砂载玻片干燥后水平放于滤纸上，用移液枪及预热至85 ℃的无菌枪头取预热至65～75 ℃的浓度为0.65%的正常熔点琼脂糖100 μL于载玻片上，迅速盖上洁净的盖玻片使其凝固，以获得黏附力强、均匀一致的琼脂糖层[10]。第一层琼脂糖准备好以后，将其放入4 ℃冰箱中预冷，待其凝固后取下盖玻片。取小麦叶片细胞核的悬浮液与预热至37 ℃的1%低熔点琼脂糖按1∶3（V/V，总体积为100 μL）混合均匀，滴在上述准备好的载玻片上，迅速盖上洁净的盖玻片，再放置到4 ℃下使其凝固。 　　1.2.3 细胞裂解 小心移去盖玻片，用吹风机小心垂直轻吹胶板平面，使残余水分蒸