脓汁及粪便标本中病原菌的检测-4.ppt

斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支， 镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张。 器材准备 染色瓶6组，染色架8个。 医学微生物学实验综合性实验一 脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四） 斜面培养物的观察 革兰染色法 肉汤接种法 显微镜油镜的使用 斜面培养物的观察 从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金黄色或白色。 从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。 为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到菌落的颜色—紫黑或粉红。 从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。 Isolation and identification of bacteria from clinical specimens (Pus Stool) -- workflow ① culture media preparation ② isolated culture of bacteria ③ pure culture of bacteria ④ morphological examination of bacteria ⑤ biochemisty, mobility, SCT AST of bacteria ⑥ serologic test, results analysis → paper writing 细菌染色法 单染色法：只用一种染料染色，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。 复染色法（鉴别染色）：采用两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。 抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌(※一些一旦用某些方法染色后，能够抵抗酸性酒精脱色的细菌)，阳性者为红色。 特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。 结核分枝杆菌 抗酸染色 麻风分枝杆菌 抗酸染色 产气荚膜梭菌荚膜 Hiss 染色 破伤风梭菌芽胞 芽胞染色 变形杆菌鞭毛 Leifson染色 白喉棒状杆菌异染颗粒 Albert染色 革兰染色法 Gram Staining 革兰染色法是丹麦内科医生 Christain Gram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有130多年的历史，仍在广泛使用。 革兰染色法原理的三种学说 通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。 等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。 革兰染色的意义 鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。 选择抗菌药物：例如G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。 了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。 革兰染色的步骤 涂片 → 干燥 → 固定→ 染色 涂片的制备 Prepare a Smear 甲→金黄，紫黑。乙→白色，粉红。 丙→金黄，紫黑。丁、戊→白色，粉红。 ↑ 细菌合适 ↑ 细菌较多 ①接种环取盐水3ul×2滴,水滴间距小于2cm。 ②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混匀，涂成大于1cm2均匀涂膜。 ③涂毕→环移至涂膜中 央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。 固定 Fixation 涂片smear 干燥dry ①手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。 ②促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。 革兰染色方法步骤 The Gram Stain Procedure 涂片 → 干燥 → 固定→ ↓ 结晶紫 → 初染1分钟→水洗→ ↓ 卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→ ↓ 95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→ ↓ 稀释品红→复染1分钟→水洗→ ↓ 吸干,镜检。 ★取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。 ★影响革兰染色的关键步骤是涂片和脱色。 革兰阳性菌 G