基于CRISPRCas9基因编辑技术在HSV―1病毒感染疾病治疗中应用sgRNA序列设计.docVIP

基于CRISPRCas9基因编辑技术在HSV―1病毒感染疾病治疗中应用sgRNA序列设计 　　【中?D分类号】R373 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）05-0-01 　　1.前言 　　在当今时代，对基因突变进行治疗，必须依靠基因编辑技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第3代基因组编辑技术。该系统的核心由Cas9蛋白以及单链引导RNA（sgRNA）组成。CRISPR/Cas系统要发挥功能必须满足两个条件：一个是SgRNA与靶点DNA序列按照碱基互补原则配对；另一个是在与SgRNA配对的靶序列3端必须紧跟PAM序列。CRISPR/Cas系统靶向新的靶点只需要合成新的SgRNA，操作简便，效率高，在基因编辑领域中被广泛应用。 　　2.实验目的 　　单纯孢疹病毒（HSV）的感染十分普遍，分为HSV-1和HSV-2，其中HSV-1是一种嗜神经病毒，主要引起生殖器以外的皮肤，粘膜和器官包括脑的感染。而HSV-1是一种DNA病毒，因此可以利用CRISPR Cas9尝试解决，从病毒的复制出发，剪切病毒DNA复制过程中的重要位点，可以达到抑制病毒复制的目的，这也为后来利用CRISPRCas9治疗其他更复杂危害性更大的病毒性疾病提供参考。 　　3.实验原理 　　3.1 CRISPRCAS/9原理 　　CRISPR/Cas9依赖于crRNA或sgRNA上的20个碱基的向导序列与目的DNA，以及PAM（NGG）序列决定切割位点的特异性。sgRNA的设计和选择是Crispr-Cas9技术的精髓，也是实验是否成功的关键一步。sgRNA决定了Cas9的靶向性和特异性[3]。对于目前广泛应用的土壤农杆菌系统来说：sgRNA序列的3‘端必须是NGG序列（例如：5′GTCACCTCCAATGACTAGGGNGG-3′），Cas9会在PAM序列5‘端大约3bp处对DNA序列进行切割。 　　3.2 sgRNA设计 　　3.2.1 设计原则 　　（1）对于sgRNA的长度，一般应为20nt左右； 　　（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%～60%； 　　（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低。 　　另外SgRNA的活性与CRISPR系统的突变效率直接相关，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到有活性的靶点至关重要，通常在设计特异性靶点后，需要进行体外细胞活性筛选，筛选出有效的靶点用于后续实验。 　　3.2.2 靶序列的选择 　　根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI中进行查找，找到该基因CDS区[4]，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。 　　4.实验步骤 　　4.1 CDS区域的选择 　　HSV-1基因组为152kb的线性双链DNA，在宿主细胞核内以级联反应的方式表达病毒蛋白。根据基因表达时序的不同，HSV-1基因可分为立即早期基因（IE）、早期基因（E）、和晚期基因。立即早期基因转录出现在病毒的DNA复制之前，立即早期基因转录后，激活随后的早期基因和晚期基因，引起病毒的复制及感染。 　　其中，ICP27蛋白就属于立即早期基因编码的蛋白之一[5]，在HSV-1生命周期的IE期产生，主要调节病毒和宿主细胞mRNA的合成与成熟，敲除ICP27可阻断HSV-1病毒的复制，是HSV-1复制必需的高保守蛋白，而且与其他孢疹病毒的基因产物存在较高的同源性。因此我们决定将Crispr的靶序列定位在编码ICP27蛋白的编码区（CDS区域）。 　　我们通过NCBI网站查找ICP27的编码区 　　（1）首先通过查找HSV-1之后查找ICP27蛋白 　　（2）在出现的搜索结果中选择HSV-1的ICP27蛋白，然后查看该结果 　　（3）在出现的HSV-1的ICP27蛋白的信息中选择CDS，单击，然后点击右下角的FASTA，最终得到ICP27蛋白的CDS区的碱基序列，根据ICP27蛋白的CDS区的碱基序列设计sgRNA。 　　4.2 目标序列选取 　　运行http：///网址，将编码ICP27蛋白的CDS序列分段输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中，