基于冠心病心肌缺血血瘀证小型猪血清核磁共振代谢组学研究.docVIP

基于冠心病心肌缺血血瘀证小型猪血清核磁共振代谢组学研究 　　DOI： 10.3724/SP.J.1096.2011.01274 　　 　　1（北京中医药大学药理教研室，北京 100029）2（首都师范大学化学系，北京 100037） 　　摘 要 通过左冠状动脉前降支放置Ameriod环制备冠心病慢性心肌缺血动物模型, 并结合冠脉造影等方法确立中医血瘀证证候，采用现代核磁共振（NMR）和模式识别技术, 分析冠心病心肌缺血血瘀证模型与假手术组小型猪4星期血清的共振氢谱，及相应代谢物谱群的变化, 开展中医血瘀证候学的研究。结果显示，该方法制备的模型4星期后确立为稳定的冠心病慢性心肌缺血血瘀证模型，PCA方法清晰地将模型组与假手术组动物分别，血清1HNMR谱的主成分分析（PCA）、两组动物代谢谱各不相同。假手术组与模型组比较发现, 血清中内源性代谢物柠檬酸、肌酸、γ-氨基丁酸、乳酸、肉碱、葡萄糖等含量上升，低密度脂蛋白（LDL）与极低密度脂蛋白（VLDL）等脂质代谢物的浓度下降。可见, 在血瘀证早期糖代谢与脂类代谢紊乱，两者互为因果，导致能量代谢中三羧酸循环（TCA）平衡的破坏，最终加重并恶化了冠心病血瘀证的进程，这些代谢物的特征组合模式可成为临床诊断与防治冠心病血瘀证的诊疗指标。 　　 　　关键词 冠心病； 血瘀证； 核磁共振； 代谢组学 　　 　　 2010-10-20收稿；2010-12-23接受 　　本文系国家科技重大专项（No.2009ZX09502-018）、国家自然科学基金（No资助 　　* E-mail: doctor_wangyong@ 　　 　　1 引 言 　　冠心病心肌缺血在世界范围内的发病率与死亡率高居首位［1］，目前主要依靠症状体征与心电图的改变、冠脉造影作诊断，花费大，不易开展，并且有创［2］。对其相关生物标记物研究尚缺乏特异性指标［3］。 　　代谢组学是对生物体内所有代谢物进行分析, 并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的研究方法。相关技术的发展使筛查与诊断冠心病, 寻找其生物标记物成为可能［4］。目前，代谢组学检测技术包括核磁共振技术（Nuclear magnetic resonance, NMR）和基于质谱的技术。其中NMR具有不破坏样品的结构和性质、检测无偏向性等特点，更适用于生物样品的检测，具有良好的临床应用前景［5］。 　　对冠心病心肌缺血的研究多基于大鼠急性结扎所致的心梗或心衰模型，不符合临床慢性心肌缺血的发病过程。小型猪作为心肌缺血的动物模型，在心血管形态学、生理学方面与人类最为接近［6］，Ameroid 环吸收体液可均匀收缩致冠脉进行性狭窄，更符合冠心病慢性心肌缺血临床发展变化的全过程。本实验建立Ameriod环所致小型猪心肌缺血模型，通过冠脉造影评估冠心病缺血程度，并结合NMR对心肌缺血后血清代谢物变化情况进行分析，进一步寻找冠心病心肌缺血血瘀证可能的代谢标记物。 　　2 实验部分 　　2.1 材料与方法 　　2.1.1 冠心病心肌缺血血瘀证模型的建立与证候判别 在本课题组前期实验［7］的基础上建立了Ameriod 环所致小型猪心肌缺血模型。术后对动物采集包括舌象在内的四诊信息，并通过冠脉造影、血流变等辅助手段进行评价。根据1986年中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制订的血瘀证诊断标准对模型动物的证候进行判定, 确定在4星期时为稳定的冠心病心肌缺血血瘀证模型。 　　2.1.2 冠状动脉造影 穿刺右侧股动脉，透视下沿钢丝分别送入造影导管至左右冠脉口，行左冠状动脉造影。术后拔除导管及鞘管，穿刺点压迫止血15 min。第2和第4星期进行冠状动脉造影，观察冠脉狭窄及心肌缺血的程度。 　　2.1.3 代谢组学检测分析与统计学处理 在300 μL血清样品中加入200 μL 0.01%三甲基甲硅烷基丙酸{3-（trimethylsiyl）［2, 2, 3, 3-2H4］propionate, TSP}, 100 μL重水（D2O），定容，以14000 r/min 离心10 min，取上清550 μL进行检测。参考文献［5］，运用NMR技术对血清进行驰豫编辑实验（Carr-purcell-meiboom-gill, CPMG）和扩散编辑实验（Longitudinaleddy-delay, LED），分别观测血清中的小分子代谢物和大分子代谢产物。CPMG脉冲序列可以压制脂类等大分子的信号，得到氨基酸等小分子的代谢信息；LED脉冲序列则可以屏蔽氨基酸等小分子的信号，得到脂类等大分子代谢物的变化信息［8］。采用预饱和方式抑制水峰, 饱和时间为2 s, 混合时间为0.15 s, 谱宽7000 Hz, 采样点数32 k, 累加次数64次, 预饱和频率