基于分子动力学模拟研究定点突变对葡聚糖酶热稳定性影响.docVIP

基于分子动力学模拟研究定点突变对葡聚糖酶热稳定性影响 　　摘要：为提高葡聚糖酶的热稳定性，对葡聚糖酶的三维结构进行模拟分析，获得2个突变体R226A、G224A，用分子动力学的方法从原子水平上研究突变体与野生型的耐热性。结果显示，突变体R226A、G224A的均方根偏差，回旋半径和静电势能等参数值要低于野生型蛋白，表明突变体的热稳定性较野生型明显上升，更有利于在高温环境下发挥其生物活性。通过计算机模拟分析的方法研究定点突变对野生型酶的热稳定性的影响，可大大节省试验时间，同时可为阐明葡聚糖酶耐热性机制提供理论依据。 　　关键词：分子动力学；定点突变；葡聚糖酶；热稳定性 　　中图分类号： S188 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0054-05 　　β-葡聚糖酶是专一作用于β-葡聚糖的1，3-及1，4-糖苷键，可产生3～5个葡聚糖单位的低聚糖及葡萄糖[1]。由于β-葡聚糖广泛存在于植物性饲料中而不能被动物所利用，进而造成饲料的饲用价值降低。此外，含有较多β-葡聚糖的饲料被动物食用后，会影响动物内源性消化酶与营养物质的接触，导致动物的消化率下降[2]。因此，在饲料的加工过程中添加β-葡聚糖酶将有效降低β-葡聚糖的不良影响，提高动物的消化率、饲料的利用率[3]。近年来，由于饲料加工过程中须经历高温高压的剧烈条件等原因，人们对嗜热 β-葡聚糖酶的研究越来越关注。 　　计算机分子模拟是以计算机及计算技术为工具和手段，运用计算数学的方法，解决复杂物理、化学、生物等问题的应用科学[4]，特别是随着近年来计算机技术的飞速发展，该手段发展越来越完善，其模拟试验所得结果与真实试验结果极为相似，因此可以辅助真实试验[5]，这样可以大大节省试验成本和人力。由于这些优点，计算机分子模拟技术被广泛应用，在生物学体系的研究中，该手段被用于解释核酸与蛋白质之间的相互作用[6]、蛋白质与蛋白质之间相互作用[7]、药物与抗原的作用机制[8]等，已经成为世界研究前沿的领域。 　　本研究在已筛选出产嗜热葡聚糖酶的嗜热脱氮芽孢杆菌并获得该酶基因序列的基础上，进一步利用分子动力学模拟的方法从原子水平上研究定点突变对蛋白质耐热性的影响，以期获得耐热性更高的突变体。但目前由于尚未有对该酶结构分子的研究，本研究中的部分氨基酸残基在该酶耐热性中的作用机制，可以为以后对该酶进行技术改造奠定理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 研究对象 　　使用引自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SR01的葡聚糖酶基因序列（登录号：YP_006712752.1），在前期研究中，该基因表达的葡聚糖酶具有较高的热稳定性，其最适温度为55 ℃，并在90 ℃下2 h仍保持80%左右的生物活性[9]；通过I-TASSER（http：///I-TASSER/）网站同源建模预测其三维结构，建模所得模型C端结构缺少22个氨基酸残基，但是由于它距离该酶的活性部位较远，故本研究将所得该结构模型直接作为试验模型，详见图1。该模型包含223个残基，1 808个原子，15个β折叠，3个α螺旋，其结构类似于三明治结构。同源结构的模板为1oq1.C，分辨率为1.70，序列相似性为6544%。 　　1.2 分子动力学模拟 　　通过同源序列分析，以及氨基酸疏水性（http：//pic.mbu.iisc.ernet.in/index.html）、氨基酸深度和活性位点（http：//.sg/tankp/intro.html）预测分析，笔者得出R226、G224氨基酸残基位于该结构模型的内部，且2个氨基酸周围存在大量的疏水性氨基酸，因此笔者可以认为，R226、G224可能不利于该酶的热稳定性。为了验证分析结果，本试验使用Deepview软件对建模结构进行定点突变，得到R226A、G224A突变体模型；采用Groamcs软件[10]进行分子动力学模拟，力场选择OPLS-AA/L全原子力场[11]，水分子选用SPCE模型[12]，为了模拟真实环境，将蛋白质置于立方体盒子中，蛋白质距离盒子边缘1.0 nm，采用周期边界条件，盒子周围被相同的盒子包围，以消除边界效应，盒子内填充spc216.gro模型水分子，添加离子使得整个系统的电荷为0，处于中性的环境中。在能量优化后，使用约束动力学的方法，进行800 ps的约束动力学模拟，通过逐步升温的方法将体系的温度从50 K升到模拟需要的温度（324、344、364 K）。之后，采用弱耦合的方法保持?w系中温度、压强（100 kPa）的稳定，温度和压强的耦合时间常数均为0.1 ps[13]，范德华和库伦作用的截断半径均为1.4 nm[14]，静电相互作用使用PME方法计算[15]，模拟步长为2 fs，对3个体系进行2