大叶山楝拮抗内生真菌DYSJ3鉴定及抑菌活性产物分析.docVIP

大叶山楝拮抗内生真菌DYSJ3鉴定及抑菌活性产物分析 　　摘要：从大叶山楝体内分离得到1株内生真菌DYSJ3，发现其对香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有较强的拮抗作用，皿内抑制率分别为61.9%、57.9%、55.3%和65.9%。通过形态学观察结合ITS序列分析，初步将菌株DYSJ3鉴定为杂色曲霉（Aspergillus versicolor）。对菌株DYSJ3产生的抑菌活性物质进行了初步分析，发现菌株DYSJ3的抑菌活性物质集中于菌丝体中，其菌丝体乙酸乙酯浸提物对多种植物病原真菌具有较强的抑菌活性，且热稳定性较好，100 μg/mL浸提物对香蕉炭疽病菌及苹果轮纹病菌具有明显抑制活性，抑制率分别为 72.7% 和62.0%。当浓度为1 000 μg/mL时，浸提物对香蕉炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜枯萎病菌、橡胶炭疽病菌、小麦赤霉病菌的抑制率均大于90%。 　　关键词：大叶山楝；内生真菌；杂色曲霉；抑菌活性 　　中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0181-03 　　大叶山楝（Aphanamixis grandifolia）为楝科（Meliaceae）山楝属（Aphanamixis） 植物，主要分布于广东、广西、云南、海南等低海拔至中海拔山地沟谷密林或疏林地区，是一种传统的中药。《新华本草纲要》记载大叶山楝的根及叶具有祛风除湿、舒筋活络及通痹等功效，为祛风止痛药。据文献报道，大叶山楝中主要含有倍半萜、二萜、三萜等萜类成分和甾体等，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性[1-3]。Zeng等从大叶山楝中分离到四环三萜、倍半萜、木脂素、苯丙素、二肽类等化合物，并选出多个具有肿瘤细胞抑制活性的单体化合物[4]；黄淼等从大叶山楝根分离得到9 个化合物，发现多个化合物对慢性髓原白血病细胞K562和人胃癌细胞SGC-7901有生长抑制活性[5]。然而，目前关于大叶山楝内生真菌的研究鲜有报道。本研究从大叶山楝体内分离出1株内生真菌DYSJ3，发现其对多种植物病原菌具有较好的拮抗活性，通过形态观察结合ITS序列分析对该菌株进行鉴定，并对其产生的抗菌活性物质进行初步分析。 　　1材料与方法 　　1.1菌株 　　内生真菌DYSJ3从大叶山楝中经组织表面消毒分离获得。 　　供试真菌：香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cubense）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp. cucumerinum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana sp. piricola）由海南大学环境与植物保护学院提供。 　　1.2培养基 　　PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水 1 000 mL。 　　LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL。 　　CM培养基：胰化蛋白胨6 g，酵母提取物6 g，蔗糖10 g，蒸馏水1 000 mL。 　　1.3菌种活化及平板拮抗试验 　　将内生真菌DYSJ3及植物病原真菌接种于PDA平板上，28 ℃培养5～7 d活化待用。用5 mm打孔器在培养5～7 d的供试内生真菌、病原真菌平板的菌落边缘取菌饼，将病原真菌置于PDA平板中央，菌株DYSJ3置于平板边缘，以只接种病原真菌的PDA平板为对照，每个处理3个重复，28 ℃培养5～7 d，测量菌落半径（mm），计算抑菌率。抑菌率=（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径×100%。 　　1.4菌株DYSJ3鉴定 　　将菌株DYSJ3接种于PDA培养基上，28 ℃培养3～7 d，从第3天开始每天挑取少量菌丝于载玻片上，在显微镜下观察气生菌丝、分生孢子等，拍照并描述特征。 　　菌株基因组DNA提取采用CTAB法[6]，利用ITS通用引物（ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。 PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTPs 2 μL，ITS 1 0.5 μL，ITS 4 0.5 μL，dH2O 18.25 μL，模板1 μL，总体积 25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃